CNP对人MSC软骨分化和分化形成软骨表型稳定性的调节作用

间充质干细胞（MSC）目前最有潜力代替软骨细胞成为软骨组织工程种子细胞。但近年研究发现，MSC作为软骨组织工程的种子细胞远非想象的乐观，其分化后的细胞表型不稳定，形成的软骨组织质量难以满足实际需要，因此探讨MSC软骨分化调节的新机制势在必行。C型利钠利尿肽（CNP）在生长板发育中发挥着重要的调节作用。我们在前期实验中首次发现，MSC表达CNP受体NPR-B，推测CNP可能通过旁分泌的方式作用于MSC,并且这种生物学作用极有可能与MSC的软骨分化甚至分化后软骨细胞表型的维持有关。基于此，本项目拟全面分析CNP及其受体在MSC及其向软骨细胞分化过程中的表达情况，通过体内外实验探讨CNP基因转染对MSC自身一般生物学性状和软骨分化的影响，同时应用CNP受体阻断剂，探讨在MSC 与软骨细胞共培养体系中CNP对MSC软骨分化的贡献。本研究有望找到MSC软骨分化调节的新机制，为指导临床应用找到新线索。

间充质干细胞（MSC）是软骨组织工程重要的种子细胞来源，但MSC在向软骨分化过程中存在表型不稳定问题，即经MSC分化获得的软骨细胞或软骨组织在体外或体内长期培养过程中会失去软骨细胞表型，导致软骨组织丧失功能，尤其是在关节软骨修复时，软骨细胞的骨化或去分化会大大减少II型胶原、GAG等特征性细胞外基质的分泌，使得软骨缺损的结构性和功能性修复大打折扣。为稳定MSC分化的软骨细胞的表型，本课题将C-型利钠利尿肽（C-type natriuretic peptide,CNP）基因引入到MSC中。CNP可促进软骨细胞的增殖及胞外基质的分泌，在软骨形成过程中调节细胞凝聚和氨基多糖合成，是生长板发育的重要调节因子。用体外器官培养的方法证实，胚15.5 天的小鼠胫骨经CNP 处理后软骨内成骨水平显著提高而矿化水平降低；若对软骨发育不良的动物（小鼠模型）给予软骨组织过表达CNP 或全身给与CNP，则其软骨发育不良可得到纠正。本课题研究结果显示，过表达CNP的MSC(MSC/CNP) 其成脂、成骨分化不受影响，而其在体外成软骨诱导的团块培养过程中，相对于未转染CNP基因的对照MSC，其II型胶原和GAG等细胞外基质的表达更稳定。动物实验则显示，过表达CNP的MSC其修复大鼠关节软骨缺损过程中，所形成的软骨组织表型更稳定，在长达12周的观察周期里一直保持稳定的II型胶原表达和丰富的GAG沉积，而对照组MSC修复的软骨缺损则仅维持了6周相对稳定的II型胶原和GAG表达，到12周时则几乎都转为阴性，显示出远期修复效果的不稳定性。本课题研究进一步印证了MSC作为软骨组织工程种子细胞其表型不稳定的特征，也印证了我们认为软骨细胞只是MSC向成骨分化的中间阶段的推测。与此同时，我们还证实，CNP作为软骨生长发育的重要调节因子，可显著稳定MSC分化的软骨细胞的表型，进而稳定基于MSC的组织工程软骨体内修复关节软骨缺损时的结构和功能。本课题研究结果为我们下一步开展基于MSC的软骨组织工程提供了指导。我们提出了一个通过CNP来稳定以MSC为种子细胞的组织工程软骨表型的构想，即通过对MSC进行基因改造使其过表达CNP或在支架材料中复合CNP蛋白，使其缓释，创造软骨缺损区局部富含CNP的微环境，以此来促进MSC分化的软骨细胞分泌GAG、II型胶原等特异性软骨基质，稳定其软骨表型，提升组织工程软骨的质量。