一种新的基于CpG岛靶标富集的全基因组甲基化分析方法及其在与肿瘤miRNA/mRNA表达谱关联分析中的应用研究

Human cancers are increasingly being recognized as having an epigenetic component that plays a major role in driving tumor initiation and progression. DNA methylation is one of the epigenetic modifications that regulate gene expression in normal and cancer tissues. Although a number of methods are available for whole genome methylation analysis, it is still very expensive to determine the methylation status of every single CpG site in the human genome. The goal of this proposal is to develop a targeted bisulfite sequencing method by combining a solution-based sequence capture method with next-generation sequencing technologies. After this new method is successfully developed, we will apply this targeted bisulfite sequencing approach to generate the epigenetic changes （5mC 5hmC）between different tumor cells (or clinical samples) in a single base resolution mapping. Finally, Using some conventional or self-develpoed bioinformatics tools, we will combine the gene expression informations (miRNA and mRNA) to find out the key methylation sites and genes in the tumorigenesis and development process. The application of the technology developed will revolutionize the current analytical methods of DNA methylation, provide digital profiles of aberrant DNA methylation for individual human diseases and offer a deep-sequencing, robust method for epigenetic classification of disease subtypes. The establishment and application of this method will helpful to determine the methylation status of every single CpG site and the associated key miRNA and mRNA in tumor, screening specific gene methylation as tumor markers of early diagnosis, and also can be used for screening small molecule drugs for cancer growth controlling. This research will have broad applications in cancer molecular biology, functional genomics and bio-medical field.

本课题提出了一种新的全基因组范围内对CGIs（CpG岛）进行液相杂交富集的方法，并与高通量测序技术相结合，对肿瘤细胞（或临床样本）的全基因甲基化状态进行单碱基分辨率作图，并与基因表达（miRNA和mRNA）信息进行关联分析，寻找肿瘤发生、发展过程中关键基因表达差异的甲基化调控的机制，同时结合部分5hmC甲基化谱的相关研究，在全基因组范围内进一步揭示肿瘤的发生过程中的表观遗传学信息。本课题希望通过建立一种有效的全基因组甲基化谱分析方法，并结合基因差异表达的关联分析，从中获肿瘤特异性甲基化图谱及其相关联的基因表达差异信息。该方法的建立及其应用有助于阐明基因组水平甲基化的改变与肿瘤发生的关系，筛选特定基因甲基化位点作为肿瘤的早期诊断标志物、恶性评估及预后的判断指标等，并可以用于筛选能够控制筛选能够控制肿瘤生长的小分子药物。本课题研究在肿瘤分子生物学、功能基因组学及生物医药领域具有广泛应用。

表观遗传的改变对于肿瘤的发生、发展是至关重要的，其中DNA的甲基化以及非编码RNA与mRNA之间的相互作用是表观遗传研究的重要内容之一。在国家自然基金面上项目的资助下，本项目主要开展了以下几个方面的研究任务：1）以培养的HepG2肝癌细胞系作为研究对象，通过不同时效（0h、1.5h、3h、6h）的TNF-α处理，分别收集总RNA，采用第二代高通量测序技术对TNF-α处理前后的HepG2细胞系同时进行去核糖体RNA链特异性建库测序，然后同时分析得到mRNA和lncRNA表达谱数据，并对差异mRNA进行了GO和KEGG注释；对差异lncRNA进行了real-time PCR相对定量分析，发现一些与肿瘤发生发展相关信号通路；2）对去核糖体建库测序结果进行了可变剪切和融合基因分析，最后将前期的miRNA表达谱结果和本次的mRNA及lncRNA分析的结果进行了LncRNA-miRNA-mRNA调控网络调控分析；3）分别同时提取0h、3h、6h TNF-α处理的HepG2细胞的基因组DNA进行RRBS全基因组甲基化分析，筛选出对于TNF-α处理敏感的甲基化位点，并进行基因组上定位注释，研究表明，通常情况下启动子区域的高甲基化会抑制基因的表达，基因内的高甲基化可能会促进基因的表达，而外显子区域的甲基化是导致胞嘧啶突变为胸腺嘧啶的主要原因，从而造成生殖细胞的致病突变和体细胞的致癌突变；4）我们主要针对启动子区域甲基化差异的基因进行进一步研究，结果显示，共有7个基因同时存在甲基化和基因表达差异，其中ITGB3、ONECUT2、LIF、RSPO3四个基因随着甲基化程度的降低，基因表达量升高，同时均对应多个miRNA，miRNA表达量既存在高表达也存在低表达情况，暗示这些基因可能主要受甲基化程度影响，关于mRNA是否是对应miRNA的靶标，还需进一步的实验验证；LOC389602和SAMD1分别表现为高甲基化高表达量、低甲基化低表达量，且对应的miRNA表达差异不显著，推测基因表达可能存在其他调控机制；PPP1R3C表现为低甲基化低表达量，同时存在多个上调、下调的miRNA，PPP1R3C在多种癌症中均表现为高甲基化状态，其甲基化程度与癌症的发生密切相关，需要进一步实验验证来说明其甲基化和miRNA对基因表达的多重调控机制。