hPolη在肝细胞对氢醌所致DNA损伤耐受中的作用机制研究

由hPolη催化的跨损伤合成在细胞对环境化学污染物的应答过程中起着重要的作用，但hPolη介导DNA损伤耐受的分子机制尚未完全阐明。本研究拟应用RNA干扰技术建立L-02肝细胞的hPolη基因缺陷细胞株，开展hPolη作用机制的研究。通过比较不同剂量HQ处理后正常L-02肝细胞与hPolη基因缺陷肝细胞之间hPolη及DNA损伤检查点蛋白（ATR、ATM、Chk1、Chk2、p53、H2AX和RPA2）在mRNA和蛋白质水平上的表达差异、检查点蛋白（Chk1、Chk2、p53、H2AX和RPA2）的磷酸化程度及其细胞生物学和遗传学特征，并结合hPolη的泛素化状况，在细胞和分子水平上探讨hPolη的不同表达水平条件下细胞对低剂量HQ所致DNA损伤的反应规律，初步阐明hPolη在肝细胞对HQ所致DNA损伤的耐受中的作用机制，从而为建立机体对HQ所致损伤的防御体系提供科学的理论依据。

人DNA聚合酶η（hPolη或Polη）是着色性干皮病变种（xeroderma pigmentosum variant，XPV）基因的编码产物，属于Y族DNA聚合酶。它在各种遗传毒性因子所诱发的跨损伤合成过程中起着重要作用。Polη缺失会在XPV病人中导致恶性皮肤癌的早期生成，并可增强紫外线诱发的致癌作用。研究表明，Polη与机体对氢醌（hydroquinone，HQ）所致毒性之间存在联系。为了进一步认识Polη在HQ所致DNA损伤耐受过程中的作用，我们采用RNA干扰技术来沉默Polη在L-02细胞内的表达，并确定Polη缺陷细胞对HQ毒性效应的易感性。在本研究中，我们在肝细胞用HQ处理之后，采用倒置显微镜观察肝细胞形态；采用MTT实验检测细胞存活率；采用彗星实验检测DNA链断裂；采用HPLC-EC法检测8-OHdG；采用激光扫描共聚焦荧光显微镜观察γ-H2AX焦点；采用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期分布状况；采用定量PCR检测DNA损伤检查点基因的mRNA表达水平；采用western blot检测DNA损伤检查点蛋白的蛋白质表达水平及其磷酸化程度。此外，我们还采用免疫共沉淀和剥离免疫印迹技术检测了Polη泛素化状况，并采用激光扫描共聚焦荧光显微镜观察了L-02细胞内Polη与泛素之间的相互作用。结果发现，Polη表达的抑制导致了HQ作用下肝细胞增生的减少，并使肝细胞对HQ所致细胞毒性的敏感性增强；Polη的缺陷明显增加了HQ所致肝细胞DNA损伤的程度；Polη表达的抑制在肝细胞内增强了HQ所诱发的细胞凋亡效应和细胞周期的S期阻滞。本研究也发现，HQ作用条件下，Polη的缺陷明显增加了Chk1、p53和RPA2在肝细胞内的表达水平；HQ可在肝细胞内引起DNA损伤检查点蛋白Chk1、Chk2、p53、H2AX和RPA2的强烈磷酸化，并且其磷酸化效应在Polη缺陷的肝细胞内得到了明显增强。此外，本研究还发现，Polη与泛素在肝细胞内共定位并相互作用，而该种作用在HQ处理下能够以剂量依赖性方式得到加强并受蛋白酶体抑制剂MG132的影响。总之，Polη可能通过调节细胞增生、凋亡、细胞周期、DNA修复、DNA损伤检查点蛋白的活化和泛素化而在肝细胞对HQ所引起的DNA损伤耐受中发挥着重要的作用。本研究可为建立机体对HQ所致DNA损伤的防御体系提供科学的理论依据。