酵母细胞表面展示系统固定化纤维素酶的关键技术研究

以木质纤维素为原料生产可再生能源具有深远的现实意义。本课题拟从建立一个对象友好的展示系统入手，实现木质纤维素降解酶系的细胞固定化，从而大大降低纤维素降解生产生物乙醇生产过程的成本。具体工作主要包括，从目前报道的具有较高活力及效率的催化木质纤维素的降解的微生物中，利用分子生物学技术克隆与木质纤维素降解相关的酶基因，并在大肠杆菌中进行活性表达；构建一个酿酒酵母细胞表面展示系统，此系统以绿色荧光蛋白作为报告基因，并预留多克隆位点，可以方便的接受外源基因的插入；将此前获得的酶基因引入上述展示系统中，进行活性展示，将活性展示的酶按一定比例混合，进行木质纤维素的多酶协同降解。

为缓解温室气体排放、减轻社会对化石燃料的依赖，以纤维素为原料发酵生产第二代燃料乙醇成为当今的研究热点。然而，纤维素酶的昂贵成本以及在纤维素水解、发酵过程中存在的技术瓶颈严重阻碍了第二代燃料乙醇的发展进程。为了降低纤维素降解生产生物乙醇生产过程的成本，本研究利用酵母细胞表面展示技术，以二倍体菌株Saccharomyces cerevisiae Y5为受体，将内切葡聚糖酶II (Endoglucanase II，EGII)、纤维二糖水解酶II (Cellobiohydrolase II，CBHII)以及β-葡糖苷酶I (Glucosidase I，BGLI) 展示在细胞表面，构建同时表达三种纤维素酶的表面展示酵母菌群系统。结合免疫荧光及酶活测定，所有纤维素酶均展示在细胞表面并以活性形式表达。同时表达EGII，CBHII和BGLI赋予了细胞直接降解无定形纤维素并发酵产乙醇的能力，将重组菌株Y5/EGII、Y5/CBHII和Y5/BGLI按1:1:1、1:2:1和2:1:1组合为不同的实验组，优化后的发酵结果显示，组合比为2:1:1的实验组效果最佳，最高乙醇浓度达到0.76 g/L，乙醇产量为0.33 g/g，相当于理论值的64.9 %。据我们所知，本文是基于二倍体酵母菌株Y5构建的集纤维素水解和乙醇发酵于一步的酵母菌群系统的首次报道。通过调节系统中不同组分的比例，来探究纤维素水解和乙醇发酵效率，该菌群系统可作为研究纤维素酶降解效率的有效工具；同时也可作为纤维素乙醇工业化生产的良好材料。