唾液酸生物制造急需的非辅酶依赖型N-乙酰葡萄糖胺异构酶的分子催化机制研究

Sialic acid Neu5Ac and its analogues have a wide range of physiological functions. Its applications in medicine, food and other industries prospect a great market demand domestic and abroad. N-acetylglucosamine 2-epimerase (Age) and N-acetylneuraminic acid lyase (Nal) are catalysts in biological manufacturing of Neu5Ac. The request of coenzyme ATP of all reported Ages is the bottleneck of low-cost and efficient bio-manufacturing of Neu5Ac. Our group discovered the only cofactor independent N-acetylglucosamine 2-epimerase, named PmAge. In this research object, we would like to create a homology model of the PmAge molecule, analyze the characteristics and properties of its functional domains, research the heterogeneous catalytic mechanism how PmAGE isomerize N-acetyl glucosamine to N-acetylmannosamine without co-activation of ATP. Guided by the catalytic mechanism, we would like to construct cofactor independent Ch1Age mutants. This process would provide relevant common methods for the rational design of elimination of cofactor. PmAge and Ch1Age mutants generated in this project can also be used as the candidate catalysts to promote existing Neu5Ac industrial biomanufacturing.

唾液酸N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）及其类似物具有广泛的生理功能，在医药、食品等行业中应用广泛，国内外的市场需求极大。目前采用N-乙酰葡萄糖胺异构酶Age与N-乙酰神经氨酸醛缩酶Nal大规模合成Neu5Ac。但已报道的Age酶均需辅酶ATP激活，这是制约Neu5Ac低成本、高效生物制造的瓶颈。本课题组自主发掘了目前唯一一个非辅酶依赖型的N-乙酰葡萄糖胺异构酶PmAge。本项目拟通过建立PmAge酶分子的三维结构模型，分析其功能结构域的特征和性质，获得PmAge以底物N-乙酰葡萄糖胺在非辅酶ATP依赖下异构生成N-乙酰甘露糖胺的催化机制。运用该机理指导构建非辅酶依赖的Ch1Age突变酶，为理性设计消除此类辅酶激活提供相关共性方法。本项目中研究的PmAge与Ch1Age突变酶，也将成为在工业生物制造Neu5Ac中具有应用潜力的生物催化剂。

唾液酸N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）及其类似物具有广泛的生理功能，在医药、食品等行业中应用广泛，国内外的市场需求极大。目前采用N-乙酰葡萄糖胺异构酶Age与N-乙酰神经氨酸醛缩酶Nal大规模合成Neu5Ac。但已报道的Nal酶在碱性条件下均趋向于分解反应，这是制约Neu5Ac低成本、高效生物制造的瓶颈。本课题组自主发掘了成功的筛选到来源于谷氨酸棒杆菌的醛缩酶CgNal，以pET-28a(+)质粒为载体，以大肠杆菌E. coliRosetta (DE3) pLysS为宿主，成功构建重组质粒pET28a-CgNal并成功进行表达。通过多步柱层析制备了高纯度的CgNal蛋白，CgNal催化反应的最适PH为8.5左右，最适反应温度为40℃，具有较高的热稳定性，CgNal的催化反应有三个底物，分别是N-乙酰甘露糖胺（ManNAc）、N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）和丙酮酸（pyruvate），分别在PH7.5和PH8.5的时候测定其Km值和Vmax值，其Km值表明CgNal相对于所有其他来源的N-乙酰神经氨酸醛缩酶，反应更偏向于唾液酸的合成方向。此外研究了不同的金属离子和表面活性剂对CgNal的影响，在PH7.5的条件下，Co2+、Mg2+和Ni2+能促进唾液酸的合成，在PH8.5的时候， Zn2+、CTAB和SDS都有明显的抑制作用。本项通过获得CgNal酶分子的晶体，解析了其三维结构，分析其功能结构域的特征和性质，获得Nal以底物丙酮酸和N-乙酰甘露糖胺缩合生成N-乙酰神经氨酸的催化机制。CgNal将成为在工业生物制造Neu5Ac中具有应用潜力的生物催化剂。