磷酸化和N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)修饰对乙酰葡萄糖胺转移酶(OGT)的调节机理研究

蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰方式，是蛋白质发挥正常功能的重要环节。N-乙酰葡萄糖胺转移酶（OGT），作为糖基化修饰的重要参与者，可以被磷酸化和/或糖基化，藉以实现对酶功能的调节。.本项目在已有OGT研究的基础上，综合蛋白磷酸化和O-GlcNAc修饰定位领域的研究成果，借助生物化学、分子生物学、细胞生物学等研究手段，对OGT磷酸化和O-GlcNAc修饰位点进行定位，通过定点突变，在酶活、蛋白亚细胞定位和蛋白相互作用三个层次上研究这两种修饰方式对OGT的调节机制。.本项目拟解决如下两个基本科学问题：（1）对OGT磷酸化∕O-GlcNAc修饰位点定位；（2）弄清细胞内磷酸化和O-GlcNAc修饰对OGT的调节机制。通过研究可望在糖基转移酶研究领域取得原创性成果，为深入了解OGT的调节机制及OGT相关疾病的靶向治疗提供必要的科学依据。

N-乙酰葡萄糖胺修饰是一种重要的蛋白翻译后修饰方式，该修饰可以影响某些蛋白的活性，细胞内分布及与其他蛋白之间相互作用。1997年，Hart等人研究结果表明OGT即可以被自身N-乙酰葡萄糖胺修饰，也可以被磷酸化修饰。本课题提出翻译后修饰对OGT功能调控的假设，并拟对OGT的修饰位点进行定位，进而研究糖基化和磷酸化修饰对OGT功能，定位和互作蛋白的影响及机制。.本项目运用多种生物学，化学研究方法研究OGT糖基化修饰，获得了大量实验数据，使我们对OGT的糖基化修饰有了更深层次的认识。通过生物质谱方法明确了OGT的7个糖基化位点（S1～S7），其中三个位点(S3,S5,S6)突变对其糖基化水平有显著影响。通过细胞外，细胞内等研究方法研究了糖基化对sOGT催化活性，发现当以CKII3K为糖受体时，糖基化修饰对sOGT催化功能没有影响，但S5,S6两个突变体会影响sOGT在细胞内底物蛋白的糖基化。通过PULLDOWN 方法研究了糖基化修饰对sOGT互作蛋白的影响，发现糖基化修饰能显著影响sOGT的互作蛋白，差异蛋白达1238种。 通过激光共聚焦方法研究了不同糖基化位点突变体对sOGT细胞内定位的影响，发现S5,S6两个糖基化位点突变对sOGT入核有明显的影响。本研究结果对蛋白O-GlcNAc修饰相关研究有重要的参考意义。