Nanog和Oct4促耳蜗支持细胞转化为毛细胞的相关研究

哺乳动物耳蜗毛细胞为特化终末细胞，损伤后的再生仍是世界性难题。因此，发现新的促毛细胞再生的调控基因，对于感音神经性耳聋的基因治疗具有重要意义。本实验室前期研究结果表明：Nanog和Oct4基因对维持耳蜗干细胞的自我更新及在耳蜗发育过程中扮演着重要角色。我们设想能否利用Nanog和Oct4的这一特性，使哺乳动物耳蜗支持细胞在特定环境作用下最终分化为耳蜗毛细胞。因此，本项目拟利用体内外实验，将Nanog和Oct4的腺病毒表达载体转染至耳蜗支持细胞，在庆大霉素、促毛细胞分化因子维甲酸及耳蜗微环境的共同作用下，通过Corti器培养，扫描电镜及免疫组化等方法评估其对耳蜗支持细胞分化为毛细胞的能力及方式的影响，从而进一步明确Nanog和Oct4基因促耳蜗支持细胞转分化的作用，以期寻找毛细胞再生的新途径。

鸟类、非哺乳动物类脊柱动物、两栖动物等，内耳毛细胞损伤后可通过相关分子和信号通路的调控下，由相邻支持细胞重新进入细胞周期，通过有丝分裂的形式形成新生毛细胞。然而，成年哺乳动物耳蜗毛细胞受损后不能再生。研究表明新生小鼠的耳蜗支持细胞仍具有有丝分裂和转分化为毛细胞的能力，但是这种能力随着年龄的增长、耳蜗发育的不断成熟以及细胞周期负性抑制因子p27Kip1表达的不断下降而降低。我们相信哺乳动物耳蜗毛细胞在特定的条件下，可通过调控相关的分子和信号通路，生成新的毛细胞。我们的研究思路是：在耳蜗中转入多潜能相关基因Nanog和Oct4，即使其分化为多潜能性的细胞；利用耳蜗细胞成长发育的特定微环境促使其定向分化，期待为哺乳动物耳蜗毛细胞再生提供新的思路。.本实验联合应用硫酸卡那霉素和呋塞米构建了快速药物性耳聋模型，此模型可用于研究Nanog基因在耳蜗毛细胞再生中作用的，并应用免疫荧光等方法对造模结果进行了鉴定；应用硫酸卡那霉素连续腹腔注射，构建了用于研究Nanog基因对于耳蜗毛细胞作用的慢速药物性耳聋模型，并应用免疫荧光、扫描电镜等方法对造模结果进行了鉴定。构建含Nanog基因的腺病毒表达载体Adv-Nanog-EGFP，并应用两种不同的耳蜗显微注射方法（中介注射和鼓阶注射），对转染的绿色荧光蛋白的分布进行了检测，并检测了两种注射方法对大鼠听力的影响。接下来，我们应用耳蜗中介注射的方法，在快速药物性耳聋模型建立后4天，通过耳蜗显微注射给予Adv-Nanog-EGFP，观察Nanog基因在毛细胞再生过程中的作用。应用慢速药物性耳聋模型，通过耳蜗显微注射术将Adv-Nanog-EGFP 注射入大鼠耳蜗鼓阶内。在腺病毒显微注射后14天，应用基底膜铺片和扫描电镜等方法观察耳蜗毛细胞形态及超微结构的变化。.在我们的模型中，耳蜗所有的外毛细胞均死亡，而支持细胞大部分存活，满足我们对于耳蜗毛细胞再生研究的要求；而多次硫酸卡那霉素腹腔注射的结果提示，耳蜗底转毛细胞基本消失，中转可见外毛细胞散在消失，而在顶转几乎未见到毛细胞消失。此模型满足我们对于耳蜗毛细胞保护作用的研究。通过比较两种注射方式的绿色荧光蛋白分布及对听力的影响，我们的结果提示：耳蜗中阶注射的听力损伤大于耳蜗鼓阶途径，但耳蜗中阶注射的腺病毒感染效率远远大于耳蜗鼓阶途径。在应用耳蜗毛细胞慢速损伤模型中，Adv-Nanog-EGFP注射组