CRISPR-Cas9介导的输卵管特异性表达转基因鸡研究

As animal bioreactors to produce recombinant pharmaceutical protein for treatment of human diseases, transgenic chickens have some advantages over transgenic livestock, such as short generation time, large egg production, and the easy scale-up of transgenic flocks. Therefore, transgenic chicken have an extensive future in bio-pharmaceuticals. However, low transgenic efficiency in chicken is always a problem. Although chicken ovalbumin promoter appears to be effective in inducing tissue-specific expression of delivered genes in transgenic chickens, but not sufficient for higher level production of foreign protein in the chicken oviduct. CRISPR/Cas9-mediated genome editing may be a promising approach to deal with the trouble. Here, we try to generate knock-in transgenic hens with oviduct-specific expression of EGFP by means of CRISPR-Cas9 system. A lentiviral vector, which contains Cas9 and the sgRNA targeted for chicken endogenous ovalbumin, and a lentiviral donor vector containing a reporter gene(EGFP) flanked homogenous recombination (HR) arms are to be co-injected to the dorsal aorta of 2.5–day old（Stage 14 HH）embryos, which will be artificially incubated to hatch. G0 transgenic roosters are screened with PCR for genotyping in semen. G1 and G2 transgenic roosters and hens with oviduct-specific expression of EGFP are to be generated by cross-testing and artificial egg incubation.

用生物反应器生产医学临床应用的药用蛋白而言，转基因鸡较转基因家畜更有优势，因为鸡具有世代间隔短、后代繁殖快、产蛋量高等优点，在生物制药领域有着美好的应用前景。目前转基因鸡存在的问题是转基因效率低下。 虽然卵清蛋白启动子能有效诱导外源基因在鸡输卵管特异性表达，但未能实现高水平表达的目的。以CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术有望解决这一难题。本研究拟将靶向作用于鸡内源性卵清蛋白基因位点的sgRNA和Cas9 慢病毒载体与含有靶位点两侧翼同源臂的2A-EGFP慢病毒供体载体共同注射2.5日龄（Stage14 HH）鸡胚背主动脉，人工孵化至出壳。 通过精液PCR进行基因型分型，以此筛选G0转基因公鸡。通过侧交实验和人工孵化获得G1、G2转基因公鸡和输卵管特异性表达EGFP的转基因母鸡。

转基因家禽输卵管生物反应器在生物制药领域有着广阔的应用前景，但存在外源基因随机整合、转基因表达可控性差等缺点，很难获得稳定而且表型良好的种禽。因此，有必要寻找更有效的方法来解决这个难题。本研究主要内容就是以2.5日龄鸡胚血液PGCs作为靶细胞，利用CRISPR-Cas9 knock-in技术，使报告基因EGFP敲入鸡卵清蛋白基因座，获得G0和G1转基因公鸡，再通过测交试验，获得输卵管特异性表达EGFP的转基因母鸡。我们经过反复试验，将CRISPR/Cas9和双链DNA donor 慢病毒载体直接注射2.5日龄鸡胚背主动脉，没有获得G0转基因鸡。尽管更换AAV载体，仍未实现目标，项目实施遇到巨大困难。于是我们改变了研究策略，先进行体外敲入试验，再进行体内敲入试验。我们首先以酶消化法结合差速贴壁法获得了原代输卵管上皮细胞（OECs），再将人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因导入OECs，建立了永生化的OECs 细胞株，为体外敲入试验提供了宝贵的试验材料；然后采用Easi-CRISPR技术，将EGFP-HiBiT成功敲入OECs卵清蛋白基因座，为体内敲入试验奠定了良好基础。体内敲入试验正在进行中。在本项目实施过程中，我们建立了一种改良的鸡胚背主动脉注射方法，并以该技术申报了1项国家发明专利（申请号：202010196673.4）；利用同一技术申请了一项国际（美国）专利（申请号：17/128,449）。依靠本项目的积累，先后获得了一项广西自然科学基金重点项目(合同编号：2018GXNSFDA281026)和一项国家自然基金项目(批准号：32060738)，为后续体内敲入试验提供了物质保证。AAV病毒包装、纯化、浓缩技术平台的建立，有益于AAV在转基因鸡研究领域的应用推广；鸡组织器官高质量冰冻切片制作方法的建立，为后续转基因表达提供了可靠的检测手段。