石斛合剂基于Glucagon/β-catenin通路调节糖异生的分子机制

The liver is the main organ for gluconeogenesis, Gluconeogenesis plays a critical role in maintaining glucose homeostasis. The liver in patients with type 2 diabetes mellitus insulin resistance appears important feature is the ability to lower insulin suppression of hepatic gluconeogenesis, Cause glycogenesis increased, resulting in hyperglycemia and glucose intolerance. beta -catenin (is the essential part of cell adhesion junction) And FoxO1 (forkhead box protein O family member 1) or Tcf7L (transcription factor 7 analogues) combination can influence the expression of key enzymes downstream , Is a key protein regulating gluconeogenesis. Previous studies in our research group (analysis of liver tissue microarray) found: The diabetic model rats and the normal group there are known functional differences of gene 1339 (P<0.05) , The expression amount of nearly a thousand genes return to normal after Dendrobium mixture treatment . And the liver tissue protein microarray analysis showed: prime decreased glucagon treatment group Dendrobium mixture, but the mechanism is not clear. This topic from the molecular mechanism of animal and cell level in diabetic rats to explore the Dendrobium mixture control is associated with beta -catenin glucagon signaling pathways affect gluconeogenesis,to provide a theoretical basis for the clinical application of compound prescription of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of type 2 diabetes mellitus.

肝脏是进行糖异生的最主要器官，肝糖异生对维持糖稳态起关键作用。2型糖尿病患者肝脏出现胰岛素抵抗的重要特征是胰岛素抑制肝脏糖异生的能力降低，引起肝糖生成增加，从而产生高血糖和葡萄糖不耐受。β-catenin（是细胞粘附结必不可少的组成部分）与FoxO1(叉头框蛋白O家族成员1)或Tcf7L(转录因子7 类似物)的结合可影响下游糖异生关键酶的表达，是调节肝糖异生的关键蛋白。本课题组前期研究（肝组织基因芯片分析）发现：糖尿病模型大鼠与正常组存在差异的已知功能基因1339个（P<0.05），经石斛合剂治疗后近千个基因表达量恢复正常。且肝组织蛋白芯片分析显示：石斛合剂治疗组胰高血糖素明显下降，但机制未明。本课题拟从糖尿病大鼠动物和细胞水平探求石斛合剂调控与β-catenin相关的胰高血糖素信号途径影响肝糖异生的分子机制，为防治2型糖尿病提供中药复方临床应用的理论依据。

本课题通过体内外实验探讨石斛合剂通过调控GCGR/PKA信号通路改善肝脏胰岛素抵抗，抑制糖异生的作用机制。 .主要研究内容. 1. 动物实验. 检测各组（正常组、模型组、石斛合剂组和二甲双胍组）大鼠空腹血糖、血脂、糖化血清蛋白等指标；采用ELISA方法检测血清胰岛素、胰高血糖素；HE染色法观察肝组织形态。RT-PCR法检测GCGR/PKA通路的肝糖异生相关基因表达情况。免疫组化法和Western-blotting法检测上述信号通路的相关蛋白表达情况。. 2. 细胞实验. 体外制备建立胰岛素抵抗肝细胞模型后，用石斛合剂含药血清浓度进行干预。干预结束后，取细胞培养上清，葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法测培养液中残存葡萄糖水平；提取细胞总RNA和蛋白，RT-PCR和Western-blotting法检测PI3K/Akt和GCGR/PKA信号通路相关的基因和蛋白表达。.重要结果. 1. 模型组大鼠升高的FBG、GSP、Fins、HOMA-IR、Glucagon水平 经石斛合剂干预后，显著下降。. 2. 模型组大鼠升高的Tch、TG、LDL、AST、ALT水平 经石斛合剂干预后，显著下降。. 3. 肝组织HE染色结果显示模型组大鼠肝细胞形状改变，细胞轮廓不清，肝小叶失去索状排列。石斛合剂能明显改善肝形态学。. 4. 石斛合剂能显著上调β-catenin、TCF7L2和下调GCGR、PKA、FoxO1、PEPCK和G6Pase的mRNA和蛋白表达，抑制糖尿病模型大鼠肝糖异生。. 5. 石斛合剂含药血清能够显著提高IR肝细胞的摄糖能力，改善IR。并通过上调InsR，下调FoxO1、PEPCK和G6Pase的mRNA表达；上调InsR 、PI3K、p-Akt、p-FoxO1，下调FoxO1、PEPCK和G6Pase的蛋白表达来抑制IR肝细胞的糖异生。.意义. 1. 石斛合剂能调节糖尿病模型大鼠糖脂代谢，改善胰岛素抵抗，改善肝脏形态学和肝功能。. 2. 石斛合剂能调控GCGR/PKA途径关键信号分子的基因和蛋白表达水平，抑制糖尿病大鼠肝糖异生。. 3. 石斛合剂含药血清能够改善IR肝细胞的摄糖能力，改善胰岛素抵抗，并通过调控PI3K/Akt信号通路的基因和蛋白表达抑制IR肝细胞糖异生。