苏云金芽胞杆菌Cry蛋白与亚洲玉米螟围食膜的互作研究

由于转基因抗虫植物的大面积商业化应用，苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）Cry蛋白杀虫机理的研究已成为国际前沿的热点领域。但是对于Cry蛋白进入昆虫中肠后面临的第一道防御屏障-围食膜在Cry蛋白杀虫机理中的作用仍不明确。本研究组前期克隆的cry1Ah和cry1Ie基因是我国从苏云金芽胞杆菌中分离的具有自主知识产权的杀虫基因，目前正在进行转基因抗虫玉米研究，有望进行生产应用。前期初步研究发现Cry1Ie蛋白能与亚洲玉米螟围食膜特异性结合，本项目拟在此基础上研究Cry1Ie和Cry1Ah蛋白与昆虫围食膜的相互作用，以明确与Cry蛋白结合的亚洲玉米螟围食膜蛋白及其作用方式，确定Cry蛋白与亚洲玉米螟围食膜结合的氨基酸位点，进而揭示它们互作的生物学意义。本项目取得的成果将为揭示Cry蛋白的杀虫作用机制提供新的思路，为Cry蛋白在转基因抗虫植物上的应用提供理论支撑。

由于转基因抗虫植物的大面积商业化应用，苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）杀虫晶体蛋白（Crystal protein, Cry）杀虫机理的研究已成为国际前沿的热点领域。本项目着重研究了作用机理中Cry蛋白与昆虫围食膜的相互作用。.研究中分别克隆并表达了Cry1Ie及Cry1Ah的三个结构域蛋白，并实现了对表达出的包涵体蛋白的复性及蛋白纯化。研究明确了结构域III在与亚洲玉米螟围食膜结合中发挥最为重要的作用，结构域II表现出极其微弱的结合。通过序列比对及结构模型的建立，设计并合成了保守肽段、Cry蛋白与昆虫中肠受体结合相关的重要肽段、位于结构表面的loop区域肽段及部分非保守肽段。结果表明保守肽段并不参与Cry1Ie蛋白与昆虫围食膜的结合，位于结构域III表面loop区域的肽段D3-L8（F607-V616）与IE648竞争性地结合了亚洲玉米螟围食膜，但是该区域不能与亚洲玉米螟中肠的刷状缘膜囊泡（brush border membrane vesicle，BBMV）发生结合；结构域II中的两个表面loop区域肽段也在结合亚洲玉米螟围食膜时与IE648竞争发生了更为微弱的竞争，这两个肽段可能正是结构域II表现出与围食膜极其微弱结合的原因。.围食膜是Cry毒素在与中肠受体作用之前必须穿过的一层重要的半透性保护屏障，主要由几丁质和蛋白质组成。项目组从围食膜的组成出发，通过蛋白质和几丁质结合两个方面，研究了Cry1Ie与围食膜的结合方式。本研究发现Cry蛋白不仅能与围食膜蛋白质（主要为分子量大小为30、32和80kDa）发生结合，还能通过整个蛋白或者不同的结构域分别与围食膜的重要组成成分几丁质发生结合，研究结果对于揭示Cry蛋白与昆虫间的互作的具有重要的生物学意义。.本研究还补充了Cry蛋白杀虫活性机理中的关键作用环节，即与Cry蛋白毒素的活性区域结合的DNA分子的去除与否直接影响到Cry蛋白毒素能否与昆虫中肠受体结合，从而影响其活性的发挥。该DNA的存在还可以保护毒素蛋白减少中肠蛋白酶的降解。 .本研究还探索了通过不同电荷的聚电解质制备微米级微胶囊，对Cry原毒素进行包裹，依据大多数昆虫中肠的碱性条件，设计并实现了碱性条件释放，提高了Cry原毒素的稳定性。为提高该蛋白的应用稳定性奠定了实验基础，并提供了解决策略。