苏云金芽胞杆菌Cry1Ac蛋白构域Ⅲ定点突变及结构与功能研究

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的定点突变对于获得毒力提高的突变株和阐明毒素的杀虫机理具有重要意义。本研究运用分子生物学理论和生物信息学技术，首次研究Cry1Ac5蛋白结构域Ⅲ中独特的β20-β21loop，我们将在丙氨酸扫描定点突变β20-β21loop结构中氨基酸的前期基础上，对所有突变子进行生物活性和突变前后结构的分析，发现关键位点，并将关键位点的氨基酸进一步突变为不同性质或不同结构的氨基酸，构建单突变子、删除突变子、双突变子和三突变子，通过对突变子的生物活性、结构特点和功能的推测分析，筛选关键突变子。将关键位点的关键突变子进行毒力变化机理分析（原毒素蛋白稳定性实验、寡聚体形成能力比较实验、结合能力比较实验等），明确β20-β21 loop的功能，为Cry1Ac的结构域Ⅲ在受体分子的识别和结合、维持蛋白的结构稳定性等方面提供新的生物学证据。

苏云金芽胞杆菌（Bt）是目前世界上产量最大、应用最广的微生物杀虫剂，其杀虫晶体蛋白（ICP）是Bt杀虫的主要活性成分。杀虫晶体蛋白的定点突变对于获得毒力提高的突变株和阐明毒素的杀虫机理具有重要意义。本研究运用分子生物学理论和生物信息学技术，研究Cry1Ac5蛋白结构域Ⅲ中独特的β20-β21loop。采用丙氨酸扫描定点突变β20-β21loop结构中氨基酸，对所有突变子进行生物活性和突变前后结构的分析，发现关键位点，并将关键位点的氨基酸进一步突变并通过对突变子的生物活性、结构特点和功能的推测分析，筛选毒力提高的关键突变子并对其功能研究。主要结果有：（1）Cry1Ac5的结构域Ⅲ上的β20-β21 loop比Cry1Aa、Cry2Aa、Cry3Aa和Cry4Aa蛋白对应的loop长，其组成的残基中两个连续的丝氨酸（S580、S581）和异亮氨酸（I585）在Cry蛋白中都非常独特。（2）在β20-β21 loop的丙氨酸扫描突变子中，S581A、 I585A对棉铃虫的致死率都有提高，而其他突变子的致死率都有不同程度下降；首次发现了Cry1Ac5蛋白结构域Ⅲ上的β20-β21 loop结构的特殊性，并第一次报道了结构域Ⅲ中的β20-β21loop结构在蛋白功能中发挥的作用（3）三维结构分析发现I549、I507和I513之间的空间距离相当，形成一个类似于等边三角形的平面。I585位于I549和I507之间且不在该平面上，它与I549、I507之间的疏水作用可能破坏I549、I507和I513三个残基的作用力平衡。I585可能与维持蛋白的稳定性有关，为其它Cry蛋白的分子设计提供了一条思路。（4）利用纯化的毒素蛋白生测，突变子I585A为1.64μg /mL，比野生型的毒力分别高1.71倍；I585V的毒力稍微降低，I585F I585T、I585E的毒力显著降低。I585F毒力著降低，可能是因为在585位引入了疏水性侧链。保守突变I585E和I585T，谷氨酸（E）和苏氨酸（T）都含有亲水性侧链，说明585位引入亲水性侧链会对Cry1Ac5蛋白的活性和稳定性带来剧烈的负效应。为Cry1Ac的结构域Ⅲ在受体分子的识别和结合、维持蛋白的结构稳定等方面的重要性提供了新的生物学证据。