基于Topsentin的金黄色葡萄球菌转肽酶小分子抑制剂及其作用机制研究

在人的多种病原体表面，转肽酶Sortase发挥着调控不同致病因子功能的关键作用，该基因的发现曾被认为是微生物学领域中最显著的成就之一。金黄色葡萄球菌SrtA的表达与表面蛋白的存在对"超级细菌"的感染是至关重要的，这为抗菌新药研究提供了全新的候选靶标。尽管在过去的高通量筛选的不懈努力中已经获得了一些SrtA的小分子抑制剂，但是效果仍远不能令人满意。最近，研究发现天然产物Topsentin具有显著的转肽酶抑制活性，然而其具体的作用机制尚不明确。因此，综合运用多学科交叉互补的研究手段，从分子和细胞水平上深入阐明SrtA与Topsentin之间的相互作用机制，开展针对具体靶标SrtA的新型抗菌药物研究极其重要。本项目的成功开展将进一步揭示转肽酶SrtA在革兰阳性细菌感染中所发挥的生物学功能，设计并验证有效的调控手段，为基于大分子与小分子三维结构的新型抗菌药物研发奠定可行的实验基础。

综合利用基于金黄色葡萄球菌Sa-SrtA晶体结构和小分子配体药效团搜索以及分子对接等虚拟筛选手段，以天然产物Topsentin A为母核结构，获得100个具有多样性结构的化合物。5个化合物对Sa-SrtA有较好的酶活抑制效果，其中化合物4的IC50为37.7 uM，好于Topsentin A （IC50为113.4 uM）。基于药物合成化学详细开展了4的构效关系研究。化合物SD9对Sa-SrtA的IC50达到了9.3 uM，对酿脓链球菌Sp-SrtA达到了IC50 0.8 uM。通过RP-HPLC进一步确证了SD系列化合物可以显著的抑制Sa-SrtA对多肽底物Abz-LPATG-Dap(Dnp)-NH2的转肽作用，并且确证了SD9是可逆的竞争性抑制剂。为了排除化合物对体外酶活实验中所使用的荧光底物的干扰，进一步生化实验结果显示SrtA可以识别天然表面蛋白的LPXTG序列并发生转肽反应。化合物SD9和SD19以浓度依赖性的方式抑制Sa-SrtA对表面蛋白SasX和IsdA的转肽反应。活体细菌水平上的实验证明SD系列化合物中多个化合物可以显著的降低金黄色葡萄球菌细胞壁上铆钉的重要的毒力因子蛋白SPA含量，并且与体外酶活水平上的抑制活性有较好的相关性，同时表现出化合物浓度依赖性。该抑制作用分别利用荧光标记定量以及Western Blotting两种不同的方法加以验证。另外，转肽酶Sa-SrtA共价交联表面蛋白凝集因子A(ClfA)和B(ClfB)在金黄色葡萄球菌的细胞壁上，它们共同介导金黄色葡萄球菌黏附宿主细胞的过程。纤维蛋白原粘附金黄色葡萄球菌实验显示浓度为100 uM的SD3、SD9和SD19化合物可以显著的降低金黄色葡萄球菌与包埋有纤维蛋白原的96孔板的粘附，50-200 uM化合物SD9可以浓度依赖性的降低金黄色葡萄球菌的粘附。总之，本课题综合利用多学科交叉的手段，针对金黄色葡萄球菌重要潜在靶标Sa-SrtA开展了化学干预研究。获得了在酶学和细胞水平上抑制病原菌致病因子的活性化合物，验证了分子水平上的作用机制。值得强调的是，该类化合物本身不具有杀菌的活性，但是可以显著抑制病原菌的致病因子，为新类型的抗菌感染提供了理论基础和先导化合物。