ClpP蛋白酶的化学生物学研究

酪蛋白裂解酶ClpP是致病菌中高度保守的核心丝氨酸水解酶。金黄色葡萄球菌ClpP与致病力密切相关，为抗菌新药研究提供了全新的候选靶标。我们的前期研究结果初步表明，金葡菌ClpP蛋白酶局部结构域的分子运动引发蛋白质整体构象的变化。为了深入探讨该分子运动对功能调控的作用机制以及在其它致病菌ClpP中的普适性，我们提出研究计划，利用非天然氨基酸定点标记、构建二硫键交联等化学生物学的研究手段，基于结构基础开展功能调控的机理研究。同时，基于晶体结构虚拟设计活性小分子化合物，深入研究小分子调控ClpP功能的结构变化特征和分子运动机制。本项目的成功开展不但将进一步揭示蛋白酶ClpP在致病菌感染中发挥生物学功能的结构基础，而且同时瞄准ClpP作为新靶标的直接验证，为基于分子间相互作用的新型抗菌药物研发奠定前提基础。本课题预期发表高水平论文2-3篇，申请专利1-2项。

研究发现在致病菌感染宿主过程中，ClpP蛋白酶对致病菌的存活和致病力发挥着极其重要的作用，因此它成为了抗菌治疗中一个极富吸引力的新靶点。我们之前的研究已经证明了ClpP在金黄色葡萄球菌中存在两种不同的晶体结构，分别是压缩型和伸展型。在这基础上，我们设计了一系列分子动力学模拟实验来探究ClpP在这两种状态中转换的机制。伸展构象SaClpP单体的长直E螺旋在经历一个解旋-复旋的过程后，会形成一个与压缩型构象单体十分相似的扭结螺旋。在分子动力学实验模拟中，我们发现了一个紧实型的中间态，随后由X射线晶体进一步证实。结合分子模拟和晶体衍射等一系列实验为功能性调控ClpP动力学及机制研究提供了全新的视野。. ADEPs是一类新的抗生素，已有研究表明它们能够在缺少ATPases的情况下激活ClpP，造成ClpP功能紊乱。通过实验我们发现功能获得性突变体，可以将SaClpP转换为不受调控的紊乱状态，然而在这种ClpPY63突变的构象中，它是如何影响并激活ClpP的仍然未知。在体内，SaClpPY63A突变体自激活水解FtsZ，并抑制金黄色葡萄球菌的生长。解析SaClpPY63A的晶体结构发现Asn42在ClpP功能活化过程中起着重要作用。同时，在低温电子显微镜图像观察到SaClpPN42AY63A突变体入口孔径增大，说明了蛋白水解的自激活活性。此外，这种工程化的蛋白酶使得休眠细胞对常规抗生素敏感。这些数据证实了ClpP激活的多米诺效应机制是类似于结合了小分子激活剂或者ATP酶。侧链Tyr63的扭曲构象是ClpP与ATP酶以及ADEPs相互作用的疏水口袋的重要部分，主要用于激活ClpP水解酶活性。为了避免位冲突，Met31的侧链落下作为多米诺效应的第一位点，随后引起Asn42侧链向下翻转，这有利于SaClpP的完全活化。我们的研究对于进一步了解ClpP家族蛋白酶作用的分子机制提供了一个坚实可靠的框架。