Alu RNA及其信号通路在急性肺损伤肺泡II型上皮细胞中的作用机理

Acute lung injury (ALI) progresses rapidly and remains a significant cause of mortality in the critically ill patients. Until rescently, there has no effective medicine in the clinical treatment in ALI. Oxidative stress is one of the high risk facts in the onset of ALI and may induce serious chronic lung diseases. It would be a promising way in the therapy of acute and progressive lung injury to interfere or block the cascade effects, which are induced by the oxidative stress and will stimulate cell damage in the beginning of ALI. In our previous study, we found and identified for the first time that amount of Alu RNA could be generated very quickly in different human cell lines under the stimulation of oxidative stress. And the phenomenon exhibited most significantly in A549. Referenc indicated that Alu RNA may form to dsRNA and induce cell degeneration and apoptosis. Therefore, the increasing of Alu RNA might induce cell damage and apoptosis in the early stage of oxidative stress and then result in pathological changes in acute lung injury. We hypothesis that Alu RNA, its associated proteins and signal pathway may play an important role in mouse alveolar type II epithelial cells (ATII) in oxidant - related lung injury. In this study, cell biology and molecular biochemistry assays will be performed to explore the functions and changes of Alu RNA and its associated signal pathway. Then the molecular mechanisms will be identified in the mouse disease model to provide not only a new clue for oxidant related ALI, but also a stable base for the study of ALI. Furthermore, this study could promote the early diagnosis and clinical therapy of ALI to a new stage.

急性肺损伤发展迅速，致死率高，至今尚缺乏有效的治疗药物和方法。氧化应激是导致急性肺损伤的重要病因，且可能引发严重的慢性肺疾病。如何在急性肺损伤早期阻断氧化应激诱导的细胞病理学改变是治疗急性和进行性肺损伤的重要途径。我们首次在人肺细胞系等证实氧化应激可快速诱导细胞内产生大量Alu RNA，其中以A549细胞最为显著。文献提示Alu RNA可形成双链RNA导致细胞退行性变和凋亡。所以Alu RNA的升高极可能在氧化应激的早期即诱导细胞发生凋亡，从而启动急性肺损伤的病程。本课题拟研究氧化应激条件下小鼠肺泡II型上皮细胞内Alu RNA与其相互作用蛋白及信号转导通路的调控和作用的变化，进一步在小鼠疾病模型中验证相关分子及信号转导通路所发挥的功能及重要意义，从而提出氧化应激条件下急性肺损伤的新机制，为该疾病的理论研究奠定基础,同时，也为急性肺损伤的早期诊断和干预的临床研究开辟新的领域。

氧化应激是多种疾病以及退行性病变产生和发展的重要病因，且可能引发多种严重肺疾病。有研究提示氧化应激可诱导Alu RNA的产生，但氧化应激过程中Alu RNA是否产生于气道相关肺疾病组织细胞，其调控的分子机制是什么尚未阐明。本课题通过建立氧化应激II型肺泡上皮细胞模型和不同Alu RNA亚型转染细胞模型，探讨Alu RNA参与氧化应激II型肺泡上皮细胞损伤的分子调控机制，为氧化应激引起的肺损伤疾病的发病机制研究提供新的理论基础。第一部分：我们首次在人肺组织相关细胞系证实氧化应激可快速诱导细胞内产生大量Alu RNA，其中以A549细胞最为显著。免疫荧光实验发现Alu RNA可与识别双链RNA的特异性抗体（J2抗体）结合，证实在该过程中产生的Alu RNA形成双链RNA结构。进一步，我们通过文库构建、DNA序列分析的方法鉴定了该过程中产生的主要Alu RNA的亚型。第二部分：（1）根据Alu Sx RNA序列构建真核表达质粒，转染A549细胞12h后，我们发现Alu Sx RNA转染可促进NF-κB的磷酸化升高，NLRP3的表达增加，促炎因子IL-18的表达水平显著升高。使用NF-κB的磷酸化抑制剂（PDTC）以及不同类型ROS抑制剂作用于Alu Sx RNA转染以及氧化应激作用的A549细胞，检测有关信号通路重要分子。结果证实，在12h内，NF-κB磷酸化活性增高参与调控NLRP3以及IL-18的表达。而12h到24h，ROS的产生主要调控NLRP3以及IL-18的表达。提示在氧化应激过程中Alu Sx RNA的升高及其活化的信号转导通路参与了细胞损伤的发生和发展。（2）将体外合成的Alu Sq RNA序列，转染A549细胞，低浓度（1ng/mL）可促进NF-κB的磷酸化升高，Beclin1、PI3KC3和LC3II表达升高，细胞出现自噬现象。使用PDTC抑制NF-κB磷酸化，可显著抑制Alu Sq RNA转染的细胞内Beclin1和LC3II表达。高浓度（10ng/mL）可促进Beclin1的表达，诱导细胞发生凋亡。本课题研究氧化应激条件下A549胞内Alu RNA与其相互作用蛋白及信号转导通路重要分子的表达变化，提出氧化应激条件下II型肺泡上皮细胞损伤的新机制，为相关疾病的理论研究奠定基础，同时，也为肺损伤的早期诊断和干预的临床研究开辟新的领域。