内源性大麻素系统在乙醇中毒分子机制中的作用

Alcohol abuse is a critical social problem. Concerns including the determination and evaluation of relevant drugs, mechanisms of the development of alcohol dependence and the toxicological process of alcohol-induced disease onsets have always been the research interests. Ethology evidences suggest that endocannabinoids system (ECS) is closely associated with the alcohol dependence reward circuits. Alcohol intoxication can alter levels of endocannabinoids (eCBs) and endocannabinoid receptor (CBR). However, serious questions remain to be elucidated including the dynamic changes of eCBs in response to alcohol intoxication and the detailed mechanisms of how alcohol interrupts the CBR signaling. In this project, acute and chronic alcohol intoxication models will be established in rats. We aim to 1) monitor the dynamic changes of endocannabinoids (eCBs) and their hydrolytic enzymes in blood and brain tissues from the established acute alcohol-intoxicated rat model, and assess their relationship with the toxicokinetics of alcohol; 2) determine the level of the cannabinoid receptor (CBR) and its distribution in rat brain reward system after alcohol dependence, and examine the toxic effect changes of the CBR agonist on rats as well; 3) explore the proteomic changes for different brain reward circuit regions in rats under chronic alcohol intoxication, and find out the potential specific biomarkers for CBR signaling. This project aims to investigate the role of ECS in the molecular mechanisms of alcohol intoxication. Conclusions obtained by our project will hopefully provide novel indicators for forensic practice and clinical diagnosis.

乙醇滥用伴随着严重的社会问题，与之相关的毒物检测及评价、形成耐受依赖及引起疾病毒理机制是备受关注的研究重点。动物行为学等方面研究表明，内源性大麻素系统（ECS）与乙醇依赖奖赏环路相关。乙醇中毒可引起内源性大麻素（eCBs）水平及大麻素受体（CBR）表达水平的改变，但分子机制尚未明了，缺乏与乙醇体内代谢相关的eCBs动态变化方面和乙醇影响CBR信号通路方面的研究。本项目将建立大鼠乙醇急、慢性中毒模型，监测大鼠乙醇急性中毒脑组织和血液中eCBs及其水解酶水平的动态变化，明确与乙醇体内毒代动力学过程间的关系；检测大鼠乙醇依赖后，脑中奖赏系统部位CBR水平和分布变化，考察CBR激动剂引起大鼠毒效反应的变化；研究慢性乙醇中毒大鼠脑组织奖赏系统不同部位的蛋白质组学变化，筛选验证CBR信号通路中特异性生物标记物。本项目将解析ECS在乙醇中毒分子机制中的作用，有望获得可用于司法实践和临床诊断的新评判指标。

长期大量饮酒会引起多种疾病，与之相关的毒物检测及评价、引起疾病的毒理机制备受关注。内源性大麻素系统（ECS）是一种独特的内源性脂类信号传递系统，近年来被证明与乙醇滥用毒理机制相关。但是，不同学者的研究结果莫衷一是，相关分子机制仍有待揭示。鉴于此，本课题从三个方面开展了研究。.首先，采用新颖的基于稳定同位素取代分析物surrogate analyte-LC-MS/MS技术建立了全血和脑组织中主要eCBs（包括AEA、2-AG及1-AG）的分析方法，并进行全面的方法学验证。其中，响应因子和平行性实验结果充分证明了方法的适用性和准确性。在此基础上，通过大鼠毒代动力学实验及涉嫌酒驾人员血液样本检测，研究了急性乙醇中毒过程中外周血液和中枢神经系统中ECS关键因子的时序性变化以及血液中乙醇浓度与eCBs的相关性。结果表明，乙醇急性中毒对ECS的影响存在组织选择性和时间效应，外周eCBs水平不能直接反映中枢eCBs水平。对小鼠乙醇慢性中毒模型研究表明，乙醇对中枢神经系统CB1R和CB2R表达的影响更为复杂，随乙醇给药时间长短和脑核团的不同而存在明显差异。.其次，课题组分别针对海马和前额叶皮质开展CBR介导的乙醇慢性中毒致脑损害分子机制的研究。结果表明，小鼠乙醇慢性中毒可引起海马细胞焦亡和炎症反应，进一步采用关键CBR亚型选择性激动剂和拮抗剂进行研究，发现CB1R选择性拮抗剂对乙醇诱导的海马焦亡有良好的抑制与神经保护作用；而对于前额叶皮质，小鼠乙醇慢性中毒可引起坏死性凋亡，进一步研究发现CB1R选择性拮抗剂能明显改善乙醇导致的前额叶皮质坏死性凋亡。.第三，通过iTRAQ-2D-LC-MS/MS技术，我们对乙醇慢性中毒脑组织奖赏系统不同区域（纹状体、海马和前额叶皮质）的蛋白质变化进行研究，并进行了生物信息学分析，筛选验证了Krt17等12个在海马和纹状体中都有显著变化的潜在的蛋白关键因子。.综上，本课题达到了预期的研究目标，证明了ECS与乙醇中毒密切相关且分子机制存在时空特异性。研究结果对阐明ECS在乙醇中毒分子机制中的作用，发现潜在的乙醇依赖临床诊断辅助指标及治疗有重要意义。