基于基因探矿和代谢组学方法从海洋链霉菌中定向挖掘阿卡他定类活性先导化合物

Acarviostatins belong to the family of the C7N aminocyclitol family, among which acarbose is the most representative. Because of its remarkable α-glycosidase inhibitory activity, acarbose has been clinically used for the treatment of type II diabetes. We have previously analysis the Streptomyces strains which were collected from the sediment off Rizhao, Shandong Province, China, in Yellow Sea, using non-target metabolomics coupled with genome mining. Three Streptomyces strains (HO1518, SMA159 and SMA4) rich in acarviostatins were discovered for the first time. Based on their HPLC-MS metabolic profiling data, metabolomics multivariate statistical analysis was conducted. After dereplication of the known compounds, several unknown MW signals of acarviostatins were discovered. Guided by these characteristic signals, six new acarviostatins with rare acyl groups were obtained from HO1518 in our primary studies, which show more significant α-glycosidase inhibitory activities than acarbose. In this project, we intends to rapidly and targeted mining the new acarviostatins from the three marine Streptomyces, then, further use this as a guide to discover more rare acarviostatins from Streptomyces strains in the same marine habitat. At the same time, the biosynthetic mechanism and the structure-activity relationship of the acyl substitutions in HO1518 will be explored in order to find lead acarviostatins with more medical values.

阿卡他定类化合物属于C7N氨基环醇家族，以阿卡波糖最具代表性，因其具有显著的α-糖苷酶抑制活性，临床上已被用于治疗II型糖尿病。我们前期利用基因探矿和非靶标代谢组学分析方法，对我国日照黄海海洋生境链霉菌菌株中的化合物进行挖掘，首次发现3株富含阿卡他定链霉菌菌株HO1518, SMA159和SMA4，对获得的HPLC-MS代谢谱数据进行代谢组学多元变量统计分析、数据库排重，快速发现阿卡他定的未知特征信号。针对该特征信号进行追踪，初步从HO1518中分离鉴定出6个结构新颖罕见的酰基取代阿卡他定类化合物，均较阿卡波糖具有更强的α-糖苷酶抑制活性。本项目拟重点以这3株海洋链霉菌为研究对象，定向挖掘结构新颖独特的阿卡他定类化合物，以此为指导探寻同一生境下的其它富含菌株，同时阐明HO1518中罕见酰基化取代的生物合成基因，探讨构-效关系，以期发现更具药用价值的新型阿卡他定活性先导化合物。

1、本项目首次基于建立的基因探矿和UPLC-QTOF-MS/MS代谢组学方法，快速鉴定3株链霉菌HO1518、SMA159和SMA4中的活性阿卡他定类化合物。全局预测并鉴定98个阿卡他定类化合物，包括80个新颖结构；并以UPLC-QTOF-MS/MS为指导，从海洋链霉菌发酵液中累计分离鉴定出15个结构新颖的阿卡他定类化合物，包括结构新型的假八糖。.2、经体外生物活性测试研究发现，阿卡他定类化合物同时表现出显著的α-糖苷酶和脂肪酶抑制活性。构-效关系及分子对接分析表明，假三糖单元的数量、寡糖链的长度和酰基侧链在其酶抑制活性作用中发挥着关键作用，尤其以富含2个假三糖核心单元（即II型）阿卡他定最佳，并确定1种具有深入开发前景的活性先导化合物—乙酰阿卡他定II03；为开展体内药理药效学研究，我们采用响应面法优化其发酵培养基，确定最佳的发酵培养基组成，并在优化培养基条件下，乙酰阿卡他定II03的产量达到21.3mg/L，较其原发酵培养基的产量（0.8mg/L）提高了26倍，最终富集乙酰阿卡他定II03约300mg用于体内药理药效学活性筛选。乙酰阿卡他定II03的体内降血糖试验表明，在给予db/db小鼠30或60mg/kg乙酰阿卡他定II03后，可以有效地抑制其餐后血糖升高。.3、通过对链霉菌HO1518进行全基因组测序和比较基因组分析，发现阿卡他定生物合成基因簇（aca基因簇）。根据aca基因簇中每个合成基因的功能，推测阿卡他定的生物合成途径，并提出一条有别于阿卡波糖的C7环醇生物合成途径。鉴于酰基侧链对阿卡他定的生物活性至关重要，我们通过RT-PCR分析、进化树构建和同源建模，确定阿卡他定基因簇中的AcaT酰基转移酶，并通过体内基因敲除、基因回补等实验进行验证。此外，我们鉴定了aca基因簇中α-葡萄糖苷酶AcaE1的功能。.4、累计发表标注有本基金资助的学术论文9篇（其中8篇SCI研究论文），申请专利5项。.5、培养博士生4名，硕士生1名。.综上所述，本论文利用基因探矿及UPLC-QTOF-MS/MS技术，快速定向挖掘3株链霉菌中的阿卡他定类化合物；探讨降糖降脂活性及其构效关系，利用分子对接模拟探讨分子机制；通过响应面法优化发酵培养基提高乙酰阿卡他定II03的产量；明确罕见酰基化产物的相关生物合成基因；有潜力开发成多靶点的抗糖尿病药物。