干扰Kinesin-12基因表达对促进再生轴突生长和抑制星形胶质细胞增生的双重作用

神经损伤后再生轴突中微管轨道的快速建立对神经损伤修复所需要的轴突运输和生长锥延伸至关重要。Kinesin-12是微管的马达蛋白，在神经元生长锥和胞体间转运短微管。我们前期研究表明：在神经元中降低其表达，可显著加快微管向轴突远端的转运，明显增加轴突长度，而生长锥面积减少。CO-IP结果显示该分子与微丝间有相互作用，推测其与轴突生长和生长锥推进中微管微丝骨架的动态变化密切相关。因此本课题拟提出并论证Kinesin-12/Myosin II异源四聚体模型，阐明该分子与微管微丝相互作用的机制。同时，在分裂细胞中Kinesin-12对双极纺锤体组装有重要作用，降低其表达可致分裂受阻进而诱导细胞凋亡。基于Kinesin-12在增殖星形胶质细胞和非增殖神经元中的不同作用，我们在大鼠体外/体内中枢神经损伤模型中干扰其表达，提出以Kinesin-12为治疗靶标的抑制胶质活化增殖、促进再生轴突生长的新思路。

本课题研究的Kinesin-12（驱动蛋白12，简称K-12）是一个微管依赖的马达蛋白，其经典作用是在分裂细胞中参与纺锤体两极的确定和分离。而对于神经元这种分裂后细胞，我们前期发现K-12失表达可以显著促进轴突生长。基于K-12在增殖的胶质细胞和非增殖神经元的不同作用，本课题设计阐明K-12在神经元生长锥动态变化中的作用及其可能的作用模式，在神经元和过度活化增殖星形胶质细胞中抑制K-12表达，达到促进轴突再生抑制胶质疤痕的双重作用。.我们在体外培养的大鼠E18神经元生长锥中观察到 K-12与Myosin-IIB有共定位并存在相互作用，干扰K-12表达和抑制Myosin-II活性能显著增加轴突的长度和向外推进能力。FRET等实验发现K-12 与 Myosin-IIB 在大脑皮层星形胶质细胞的lamellar区共定位。CO-IP等蛋白互作实验表明K-12 与Myosin-IIB可以通过其分子上的Myosin-tail直接相互作用，且其相互作用与K-12蛋白T1142位点磷酸化有关。本研究首次发现K-12和Myosin-IIB两个马达蛋白可能形成异源聚合体形式，进而联系微管微丝调整细胞骨架重构。.为探明干扰K-12基因表达对促进再生轴突生长和抑制星形胶质细胞增殖活化的双重作用，我们分别在联合培养的DRG 神经元和星形胶质细胞中降低K-12表达后，进行机械划伤轴突，发现降低K-12可显著促进损伤轴突生长。在星形胶质细胞中敲降K-12，能抑制细胞增殖并促进迁移，并增加了细胞凋亡和G1阻滞，改变了Myosin-IIB的分布。这可能与K-12/Myosin-IIB聚合体对分裂细胞中星体微管和中心体的位置影响有关。.我们采用成年大鼠脊髓挫伤恢复模型研究发现，敲降K-12可以改善大鼠运动功能，减小脊髓空洞面积，增加NF表达以及损伤远侧端再生的轴突数， 降低GFAP和CSPGs的表达。表明脊髓损伤动物体内干扰K-12表达，可以抑制胶质疤痕、促进轴突再生。此外我们还研究了K-12和Myosin-IIB在斑马鱼胚胎发育中的表达情况，通过在干扰胚胎发育中K-12的正常表达，在体水平阐明了K-12在斑马鱼胚胎神经发育过程中扮演的重要角色。.通过本课题的研究，我们较为全面地阐明了Kinesin-12（即K-12）和Myosin-IIB在神经系统发育和损伤再生中的作用关系。.