大鼠低血糖性脑水肿的分子机制研究

The decrease of blood glucose level resulting in sympathetic arousal or central nervous system dysfunction is called hypoglycemia, which has more severe immediate brain injury than hyperglycemia. Recurrent attacks of hypoglycemia can lead to mental decline and accelerated brain dementia.Acute hypoglycemia can cause cerebral edema, which often brings irreversible damage to blood brain barrier and is an important cause of hyperglycemic brain injury. As so far, the origin and development mechanism of hypoglycemic cerebral edema has not yet been fully elucidated. Our initial study found that aquaporin-4 and tight junction proteins played a very important role in hypoglycemic cerebral edema. Based on the reports from other labs and our own previous studies，we presumed that aquaporin-4 and occludin of tight junction proteins interact with each other during hypoglycemic cerebral edema. In this study, we plan to demonstrate the interactions between aquaporin-4 and occludin in cocultured astrocytes and brain microvascular endothelial cells of SD rats. We are determined to confirm the effects of the interaction between aquaporin-4 and occludin on hypoglycemic cerebral edema in vivo and in vitro, and explore the molecular mechanism of hypoglycemic cerebral edema. This study would provide a fundamental theory and practical basis in the prevention and treatment of hypoglycemic cerebral edema.

血糖降低导致交感神经兴奋或中枢神经功能障碍称为低血糖症。低血糖较高血糖具有更迅速、直接且严重的危害；反复发作可导致永久性脑功能障碍及痴呆；急性低血糖可引起血脑屏障（BBB）损害及脑水肿，是低血糖性脑损伤的重要原因之一。但迄今为止，低血糖性脑水肿发生和发展的分子机制尚未阐明。我们前期研究表明AQP4和BBB紧密连接蛋白在低血糖性脑水肿中有重要的作用，结合文献学习及前期实验基础，我们提出"AQP4和紧密连接蛋白Occludin有着相互作用关系，在低血糖性脑水肿的发生中共同起作用"。基于此，本项目拟在共培养的SD大鼠大脑星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞中证实AQP4和紧密连接蛋白Occludin的相互作用，并从体内和体外两个方面证实AQP4和Occludin在低血糖性脑水肿中的作用，进一步阐明大鼠低血糖性脑水肿的分子机制，为低血糖性脑水肿的早期防治提供新的思路和靶点，具有重要的理论价值及临床意义。

低血糖最容易导致脑损伤。脑水肿是低血糖性脑损伤的重要原因。本课题组在前期“葡萄糖再灌注性脑损伤”概念提出的基础上，主要研究了低血糖大鼠脑水肿发生的分子机制及脑损伤的新的作用靶点。基本取得了预期成果，具体内容如下：（1）根据文献，建立标准的严重低血糖大鼠模型，证实了低血糖性脑水肿的发生和血脑屏障破坏，研究发现低血糖大鼠在恢复血糖后脑组织内AQP4的表达量明显增加，而紧密连接蛋白Claudin-5、occludin、ZO-1在低血糖后脑组织内表达量持续性降低，这一变化趋势与低血糖大鼠脑水肿的发生和血脑屏障破坏明显相关。（2）体外细胞系CTX-TNA2转染AQP4质粒进一步证实AQP4与低糖后星形胶质细胞细胞体积变化相关，提示AQP4参与了低糖后星形胶质细胞水肿的发生。体外transwell培养的微血管内皮细胞经过低糖培养，证实了低糖时Claudin-5表达降低，微血管内皮细胞旁通透性增加，而外源性VEGF可以抑制Claudin-5表达量在低糖时下降和上调Glut-1的表达，从而增加葡萄糖的转运，减少低糖时内皮细胞凋亡，减轻低血糖时血脑屏障破坏。（3）运用AQP4敲除小鼠建立低血糖模型，研究发现AQP4 -/-小鼠较AQP4 +/+小鼠在发生低血糖后Claudin-5表达量下降程度减少，血脑屏障损伤程度轻。其可能机制为低血糖小鼠体内PPAR-r和HO-1降低，而敲除AQP4可以逆转低血糖小鼠PPAR-r和HO-1的降低从而减轻血脑屏障的破坏。（4）探索性研究了低血糖时脑损伤的新机制：运用蛋白组学方法筛选出低血糖大鼠脑组织差异表达蛋白DJ-1、NDRG1、Clusterin、INPP4a并进行验证；通过siRNA沉默DJ-1的表达研究发现抑制DJ-1的表达后AMPK 通路受损，mTOR 活性升高，自噬活性明显降低，从而加重低糖时星形胶质细胞死亡，间接提示DJ-1在低糖时星形胶质细胞内通过促进自噬起到保护作用。通过本项目研究，取得了以下重要成果：（1）初步阐明了低血糖大鼠脑水肿发生的分子机制；（2）发现低血糖脑损伤的新的研究靶点，为进一步研究低血糖脑损伤提供了新思路。本项目已毕业二名博士生和两名硕士生，一名博士生在读，相关研究内容已发表SCI论著5篇，统计源期刊论文5篇。另外有研究结果正在整理投稿，计划发表SCI文章2篇。