杯状细胞内大分子拥挤环境对气道黏液高分泌黏蛋白组态的影响

While acute exacerbation of COPD and acute attack of asthme, goblet cell is obese extraordinarily containing excessively glycosylated and sulfated mucin 5AC which aggravates the initiate intracellular environment of macromolecular crowding. This pathological macromolecular crowding could cause configuration alteration and abnormal aggregation of mucins probably by impacting the enzyme decoration and fold of MUC5AC, further up exacerbating the macromolecular crowding and forming a vicious cycle. We study the impact of activity and enzymatic dynamics of ppGalNAc-T2 and N-Acetylglucomaine-6-O-Sulfotransferase (GLcNAc-6-O-ST) in macromolecular crowding environment, that attempts to reveal the mechanism how macromolecular crowding leads MUC5AC exceed glycosylation an sulfation. Comparatively analysing the different effect of folding and aggregation between MUC5AC, deglycosylated MUC5AC and desulfated MUC5AC in macromolecular crowding environment to confirm indirectly that macromolecular crowding reagents probably exacerbate the fault fold and aggregation of glycosylated and sulfated MUC5AC. Chaperones can assist mucins to fold forming nature mucin in the bad environment like macromolecular crowding. Overcoming these impacts caused by macromolecular crowding and exploring the therapy function of chaperones will provide new direction of chronic airway inflammation treatment.

慢性气道炎症时，气道杯状细胞肿胀肥胖，细胞被异化的黏蛋白（MUC）5AC充满，呈现超乎寻常的胞内大分子拥挤状态。此种病理性大分子拥挤通过对MUC5AC酶修饰、折叠、聚集等的影响，导致黏蛋白组态改变、异常聚集，最终胞内大分子拥挤进一步恶化，从而呈现气道黏液高分泌的负性特征。本研究通过分析MUC5AC糖基化酶ppGalNAc-T2和硫酸化酶GLcNAc-6-O-ST在大分子拥挤背景下酶活性、酶促动力学等的改变，揭示大分子拥挤状态对MUC5AC糖基化和硫酸化修饰的影响机制；对比分析大分子拥挤试剂对MUC5AC、去糖基化MUC5AC、去硫酸化MUC5AC折叠、聚集的差异作用，试图证实大分子拥挤可能加剧过度糖基化、硫酸化MUC5AC的错误折叠及聚集。分子伴侣可协助黏蛋白的正确折叠，一定程度弥补大分子拥挤的不利影响，本研究亦探寻相关主要分子伴侣BIP的辅助效应，以期为慢性气道炎症的防治提供新思路。

背景与主要研究内容：近年来在细胞学、分子生物学等领域中，“大分子拥挤”状态日渐为研究者重视，但目前在呼吸系统的相关研究中，却鲜有对粘液高分泌状态下杯状细胞内大分子拥挤环境所继发效应的报道。慢性气道炎症急性发作时，细胞超微结构显示细胞内黏蛋白（以MUC5AC为主）堆积。故推测，细胞内大分子拥挤环境推动 MUC5AC 的酶修饰、折叠及异常聚集，而这种黏蛋白大分子的异常聚集又将加剧原有的细胞内大分子拥挤，最终形成恶性循环。催化MUC5AC糖基化及硫基化最重要的酶是ppGalNAc-T2和GLcNAc-6-O-ST，故推测气道黏液高分泌时，这两种酶不仅表达增加，且杯状细胞内大分子拥挤更对其参与的酶促反应有极大推动作用。本实验在以上理论基础上体外模拟细胞内大分子拥挤环境，构建ppGalNAc-T2和GLcNAc-6-O-ST酶促反应体系，通过测量 Km、 Kcat 及 Kcat/Km 值，并绘制动力学曲线了解大分子拥挤其酶活性及酶促反应动力学的影响，深入了解大分子拥挤环境对MUC5AC在炎症病理状态下的影响及机制，为慢性气道炎症的治疗提供新的方向。.重要结果及关键数据：成功制备 ppGalNAc-T2 酶蛋白并经 Western 印迹验证，提纯 ppGalNAc-T2 酶蛋白。采用光吸收法测定完成 ppGalNAc-T2 质量浓度测定，使用两种检测方法完成并绘制ppGalNAc-T2 在不同大分子拥挤环境中的酶动力活性-浓度和酶活性-温度的曲线图和柱状图，得出结论：在模拟细胞内的拥挤环境下，ppGalNAc-T2酶活性明显增强，浓度越大酶活性越高，其中BSA的酶促作用最明显，温度50-60℃之间酶活性最高。成功构建MUC5AC硫酸化的关键酶GLcNAc-6-O-ST，并经 Western 印迹验证。.科学意义：国内鲜有类似针对大分子拥挤环境对酶活性的研究，本实验采用中性大分子试剂充分模拟体内细胞的大分子拥挤环境，意为还原活体细胞内的真实情况，从而得到与机体环境更加匹配的研究结果；最终发现ppGalNAc-T2酶活性与大分子试剂浓度正相关，在大分子试剂浓度为200g/L时达到最大。本实验初步验证了大分子拥挤环境对ppGalNAc-T2的影响，对病理状态下杯状细胞高分泌机制的探究又提出了一条新的线索。