EPA、DHA调节杯状细胞黏液分泌影响溃疡性结肠炎发生作用及机制研究

Colitis often leads to a decrease of the patient's quality of life and an increase of the risk for colon cancer. It has been shown that the intake of n-3 poly-unsaturated fatty acids is negatively related to colitis occurance. However, the precise role of EPA and DHA is still unclear. Previous data of our team showed that EPA intervention markedly inhibited the colitis of mice with a significant increase of mucin in goblet cells, while DHA did no show any protective effect. It is well known that goblet cells produce mucin and secrete it into lumen to make mucus layer, contributing to colon epithelium barrier. Recently, NLRP6 inflammasome has been found to activate autophagy and induce mucus secretion of goblet cells. In addition, application of PPARγ agonist was reported to activate NLRP6 inflammasome and promote the renewal of injured colon epithelium. It is reported that EPA activated PPARγ and promoted formation of autophagosome, moreover the efficiency of EPA to activate PPARγ is higher than DHA. Base on above evidences, it was proposed that EPA and DHA may influence colitis by regulating mucus secretion of goblet cells via PPARγ/NLRP6/autophagy pathway. The PPARγ knockout mice and LS174T goblet-like cell line will be used in the present study to clarify the effect of EPA and DHA on the DSS-induced colitis and uncover the role of mucus secretion as well as PPARγ/NLRP6/autophagy pathway to provide scientific evidence for develop the effective intervention measure of colitis.

溃疡性结肠炎影响患者生活质量、增加患肠癌风险。人群研究显示结肠n-3多不饱和脂肪酸水平与肠炎呈负相关，然而EPA、DHA对肠炎的确切作用尚不清楚。杯状细胞合成黏蛋白、分泌黏液对于肠上皮屏障至关重要，新近研究显示NLRP6炎症小体激活自噬是诱导黏液分泌的重要通路。课题组前期发现EPA显著升高杯状细胞黏蛋白含量、抑制小鼠肠炎形成，DHA无抑制作用。研究发现应用PPARγ激动剂可活化NLRP6、促进肠上皮修复，EPA可激活PPARγ、增强自噬，与DHA相比、EPA活化PPARγ能力更强。为此，我们提出假设“EPA、DHA通过PPARγ/NLRP6/自噬通路调节杯状细胞黏液分泌影响溃疡性结肠炎发生”，利用PPARγ敲除鼠和LS174T杯状样细胞探讨EPA、DHA能否拮抗葡聚糖硫酸钠诱导的肠炎，分析杯状细胞黏液分泌及PPARγ/NLRP6/自噬通路的作用，为探索有效的肠炎干预措施提供科学依据。

本研究对比分析了n-3长链多不饱和脂肪酸（n-3PUFAs）的主要成员二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）对溃疡性结肠炎（UC）发生的抑制作用，并从黏液屏障的角度解析了两种n-3PUFAs的作用机制以及转录因子过氧化物酶体增殖体激活受体（PPARγ）的作用。本研究揭示了EPA、DHA对于溃疡性结肠炎（UC）均呈现抑制作用，明确了与 DHA 相比，EPA 抑制肠炎发生作用更为明显。具体表现为：EPA干预显著降低了疾病活动指数评分、结肠水肿与结肠长度指数和组织病理学评分以及血清促炎因子 TNF-α、IFN-γ和 IL-6 水平。通过对两种n-3PUFAs的作用机制进行深入分析，明确了EPA、DHA干预的作用机制与抑制免疫细胞向肠道的浸润、下调IL-6/STAT3、TLR4/NF-kB、NLRP3/IL-1β炎症信号通路活性有关。细胞实验显示，EPA、DHA具有促进杯状细胞黏液形成的作用。本研究进一步着重从调节黏液屏障的角度深入解析了EPA改善UC作用的机制以及PPARγ在其中发挥的作用。通过动物实验发现 EPA可上调 Wnt/β-catenin 通路，促进 SPDEF和ATOH1介导的上皮细胞增殖和杯状细胞分化，缓解炎症相关的杯状细胞耗竭；上调PPARγ/NLRP6 通路，刺激黏液的合成与分泌，增加黏液内层厚度；增强黏液岩藻糖、硫酸化和唾液酸化修饰，发挥加强黏液屏障作用；上调促黏液更新的 Akkermansia muciniphila丰度也是作用机制之一；应用 PPARγ抑制剂后，EPA促进缓解作用明显降低。分子对接结果显示 EPA、DHA、丁酸、5-氨基水杨酸和罗格列酮与转录因子 PPARγ配体结合结构域具有相似的结合方式，其中 EPA与 PPARγ LBP 的疏水作用力和氢键的氨基酸数更多且拟合度更高；提示 EPA对PPARγ具有更强的靶向性。本研究还通过构建慢性UC小鼠模型，分析了EPA预防性干预和治疗性干预对UC的缓解作用。结果显示预防性EPA干预呈现更为明显的促进UC缓解作用。通过机制分析，发现EPA的作用机制主要涉及上调YAP/TAZ及Wnt/β-catenin通路活性、调节肠道菌群，发挥促进上皮修复的作用。PPARγ是EPA的作用靶点，因为抑制PPARγ的活性，即阻断了EPA的促进肠炎缓解作用。本研究结果支持EPA在UC防治中具有应用前景。