基于蛋白质组学的DHPM促进蛋白质糖基化反应的机制研究

Previous study discovered that DHPM could change the protein structure and promote protein glycation. We also found that the glycation sites and extent were closely related to the tertiary structure of protein. However, the mechanism of DHPM promoting glycation is still ambiguous. According to the above scientific problems, three kinds of protein, including β-lactoglobulin, bovine serum albumin and α-lactalbumin, which are diversely sensitive to high pressure are studied. The protein is glycated with sugar after DHPM modification. The reaction is monitored by measuring the glycation products at different conditions. Proteomics based on biological mass spectrometry techniques (such as HPLC-FTICR-MS, ETD-MS, LTQ-MS/MS, HPLC-HDX-MS, etc.) are empolyed to identify the glycation sites accurately, measure and calculate the glycation extent specificly as well as charaterize the structure and spatial conformational change of the glycated protein. Combined with the folding information of the protein modified by DHPM and utilizing the statistics, the mechanism of the DHPM promoting glycation is clarified based on the protein chemistry from the molecular level and folding dynamics. This project can provide basis for protein precise modification, the DHPM application in food industry as well as impart guidance for safety control during food processing.

前期研究发现DHPM会改变蛋白质的结构，促进其糖基化修饰，且修饰位点和修饰程度与蛋白质的高级结构密切相关，但是DHPM促进糖基化修饰的机制尚不清楚。针对上述科学问题，拟以三种对压力敏感度不同的蛋白质（β-乳球蛋白，牛血清白蛋白，α-乳白蛋白）为研究对象，经DHPM改性后，对其进行糖基化修饰；通过测定糖基化产物监测其反应历程；采用基于生物质谱的蛋白质组学（HPLC-FTICR-MS,ETD-MS,LTQ-MS/MS,HPLC-HDX-MS等）对糖基化修饰位点进行精确定位，计算和表征其糖基化修饰程度；并对糖基化蛋白质的结构和空间构象进行解析，结合DHPM改性蛋白质的去折叠动态变化信息，采用统计学方法，在蛋白质化学的理论基础上从分子水平和折叠动力学方面探清DHPM对蛋白质糖基化反应的促进机制，为蛋白质的定向改性提供理论基础，为DHPM在食品工业中的应用提供理论依据，为食品加工过程中的安全控制提供指导。

前期研究发现DHPM会改变蛋白质的结构，促进其糖基化修饰，且蛋白质的修饰位点和修饰程度与其高级结构密切相关，但DHPM促进糖基化修饰的机制尚不清楚。因此，本项目以β-乳球蛋白(β-LG)、牛血清白蛋白(BSA)、α-乳白蛋白(α-LA)为研究对象，结合DHPM和糖基化反应对其进行修饰；采用氢氘交换质谱技术研究不同压力改性BSA的结构，建立DHPM改性BSA的折叠动力学；运用光谱技术对改性α-LA的一级、二级结构和空间构象进行表征；通过控制反应条件（温度、反应时间、糖种类等）测定不同糖基化条件下糖基化产物含量的变化，监测其反应历程；通过DHPM协同糖基化反应改性β-LG及α-LA，研究其与IgE的结合能力；采用质谱技术鉴定各种改性蛋白质在不同反应条件下的糖基化程度、糖基化位点，并准确鉴定各个肽段的糖基化修饰程度，同时对糖基化蛋白质的结构和空间构象进行解析。结果显示：DHPM处理使BSA结构被破坏，总体结构变松散，结构域II和III趋于去折叠状态，结构域I被保护，趋于稳定；DHPM处理能够显著提高BSA-葡萄糖体系、BSA-葡聚糖体系、BSA-乳糖体系的糖基化程度，改变其一级、二级、三级结构，能够增加糖基化产物的生成。而相对于天然α-LA，DHPM处理后α-LA的分子量和二级结构没有显著变化，三级结构发生显著变化。DHPM预处理协同糖基化反应能有效地降低β-LG与IgE结合能力，β-LG与半乳糖发生糖基化反应形成的共轭物和β-LG自身形成的聚合物可掩盖β-LG的致敏表位，降低其与IgE结合能力。DHPM处理改变β-LG结构及空间构象，促进其糖基化反应，增加糖基化位点及糖基化程度，进而更大程度上地掩盖β-LG的致敏表位，最终降低其过敏性。DHPM预处理协同糖基化反应可改变α-乳白蛋白的结构，降低其与牛乳过敏患者血清中IgE抗体结合能力。这些结果为蛋白质的定向改性提供理论基础，为DHPM在食品工业中的应用提供理论依据，为食品加工过程中的安全控制提供指导。