一种新的CD44剪切变异体与乳腺癌细胞耐药关系及其机制研究

我们前期研究在乳腺癌耐药细胞株MCF-7/Adr中发现了一条新的人CD44剪接变异体，命名为CD44v16，GenBank登录号：FJ216964，初步功能研究发现CD44v16与乳腺癌细胞耐药相关。在此基础上，本课题拟进行以下四个方面的研究：一是从临床分析入手，探讨CD44v16和乳腺癌耐药的相关性；二是采用分子生物学技术增加敏感乳腺癌细胞中CD44v16的表达或沉默耐药乳腺癌细胞中CD44v16的表达，探讨CD44v16对乳腺癌细胞耐药特性的影响；三是从耐药基因转录调控、信号转导环节研究CD44v16调节乳腺癌细胞耐药的分子机制；四是检测在乳腺癌耐药发生过程中CD44v16和P-gp等蛋白之间是否存在相互作用并鉴定其作用的结构域，阐明CD44v16参与乳腺癌耐药相关的信号网络。这一研究将对于寻找有效靶点克服乳腺癌细胞多药耐药，提高乳腺癌化疗疗效具有重要意义。

乳腺癌化疗耐药机制研究及寻找影响耐药发生发展的靶分子对指导乳腺癌临床治疗具有重要价值。课题组在耐药细胞株MCF-7/Adr中发现了一条新的人CD44剪接变异体CD44v16，GenBank登陆号：FJ216964。本研究进一步探讨这一新变异体与乳腺癌细胞耐药的关系及其相关机制，结果如下：（1）乳腺癌临床标本中CD44v16阳性表达率明显高于对照组； III~IV期、淋巴结转移及骨髓浸润患者的CD44v16阳性表达率和pAKT表达强度明显升高；CD44v16阳性表达与P-gp的表达强度及pAKT积分均呈正相关；与化疗疗效成负相关。（2）将CD44v16转染MCF-7后细胞对阿霉素的IC50值提高18倍，mdr1、mrp1、bcr/abl基因表达上调，PKC活性升高，NF-κB p65阳性细胞明显增多。在凋亡诱导剂As2O3作用下，实验组细胞凋亡数量明显少于对照组。（3）将CD44 shRNA转入MCF-7/ADR细胞，转染组mdr1基因表达较对照组降低60％，对阿霉素、足叶乙甙、长春新碱和顺铂的IC50值均明显低于对照组，细胞内Rh123的浓度明显高于对照组。（4）在诱导性耐药的MCF-7细胞中，核蛋白与mdr1启动子C-box序列结合力增加，耐药组细胞mdr1启动子活性明显增强。阿霉素作用于MCF-7细胞后AKT磷酸化增强，PI3K/AKT信号通路被激活。LY294002作用后阿霉素诱导的mdr1基因转录和P-gp表达下降70％，同时阿霉素诱导的CD44v16表达也被明显抑制。在耐药细胞MCF-7-CD44v16和MCF-7/ADR中，免疫共沉淀技术检测发现内源性的CD44v16与P-gp以复合物的形式存在。（5）CD44v16高表达乳腺癌细胞中Bcl-2基因表达增高，Beclin1和Lc3-II表达减少，细胞内自噬泡聚集减少，而CD44v16低表达组Bcl-2基因表达降低；过表达CD44v16组加入Bcl-2抑制剂HA14-1后自噬泡重新聚集，Beclin1蛋白恢复表达，P62降解增加，LC3II升高；证实CD44v16通过上调Bcl-2从而抑制Beclin1，实现对As2O3诱导的MCF-7细胞自噬的抑制。这一研究为临床上寻找有效靶点克服乳腺癌细胞多药耐药，提高乳腺癌的化疗疗效提供了新的方向。