cN0期喉鳞癌患者前哨淋巴结微转移检测及关键性microRNA鉴定与功能研究

颈淋巴结隐匿性微转移是影响临床检查阴性（cN0）喉鳞癌患者治疗效果的主要因素，也是造成转移和复发的主要原因。本项目从临床实际问题出发，紧密结合前期国家自然基金（No30271399；30772405）研究基础，拟确定一种术前准确判定淋巴结微转移的检测方法，寻找早期诊断淋巴结微转移的关键性miRNAs。课题首先运用前哨淋巴结（SLN）显像联合18F-FDG PET-CT显像对喉癌前哨淋巴结微转移情况进行术前评估，结合术后病理学检查，判定联合显像法评估SLN微转移准确性和特异性，探索一种确定淋巴结微转移的新方法；其次通过对淋巴结微转移组和非转移组喉癌及癌旁组织的miRNAs表达谱分析，确定与微转移相关的关键性miRNAs并进行生物信息学预测及功能分析与验证；最后结合术后随访，分析这些特异性miRNAs标记物与cN0喉鳞癌患者预后的关系，评价其临床应用价值，实现基础研究向临床实践的转化。

对于cN0喉鳞癌患者，特别是处于T2-T3期，术前联合PET/CT与SPEC/CT对SLN进行定性及定位分析，同时参考SUV值可有效预测区域性SLN微转移。术中使用γ探测仪进一步定位SLN，有助于手术方案选择的合理性及颈清术范围的准确性。以期在根治肿瘤的同时尽量减少不必要的手术创伤，提高患者术后生活质量。发生SLN微转移的cN0喉鳞癌中存在差异microRNA及转录组差异基因表达谱，应用6例配对的喉鳞癌及癌旁正常黏膜新鲜标本（3对cN0/pN+及3对pN0），进行microRNA 阵列分析转移癌中特有的差异性microRNA表达谱；利用Agilent human miRNA 8*60K V19.0芯片，获取两组样本间的差异microRNA表达谱。转移癌中获得差异microRNA 63个，非转移癌组中获得差异microRNA 52个，将两组差异基因行“维恩”分析，共有性差异microRNA 18个，转移癌独有性差异microRNA 45个，非转移癌独有性差异microRNA 34个，利用mRNA芯片（Agilent Human mRNA 4*44K 芯片），追加检测编码基因在转移性喉鳞癌和非转移性喉鳞中的差异基因表达谱，并与先前的microRNA表达谱联合分析，首次得出与转移相关的microRNA-mRNA negative correlation profile。转移癌组中获得差异基因 2836个，非转移癌组中获得差异基因 1183个，将两组差异基因行“维恩”分析，共有差异基因 583个，转移癌独有差异基因 2253个，非转移癌独有差异基因 600个。通过GO/KEGG分析发现转移癌中上调的mRNA显著富集于细胞迁移/黏附/侵袭/细胞恶性增殖/细胞代谢。从中挑选hsa-miR-145-5p，hsa-miR-204-5p，hsa-miR-130b，hsa-miR-155及hsa-miR-301-3p重点研究。利用体外、体内细胞功能实验、双荧光报告检测、Loss-of-function、Gain-of-function、共聚焦、电镜等技术探讨他们与喉鳞癌转移侵袭能力中的作用及相关分子生物学机制。