鉴定与喉鳞状细胞癌颈淋巴结转移相关的microRNAs及其功能分析

喉鳞状细胞癌（LSCC）伴随的颈淋巴结转移对其治疗方案的选择及预后的判断至关重要，但目前临床上对于转移的检测较为局限，缺少分子水平的确切指标。本项目在前期应用microRNA芯片技术分析比较颈淋巴结转移阳性和阴性两组LSCC患者中miRNA表达差异的基础上，选取4个在扩大的样本量中经实时定量PCR验证后的miRNA分子，分析其作为LSCC转移检测分子指标的可能性，并深入探讨其在的颈淋巴结转移中的功能机制。利用基因转移分别在 LSCC细胞系中过表达或抑制上述miRNA，通过体内外实验观察其是否对LSCC细胞系转移能力产生影响。随后采用生物信息学方法预测并鉴定靶基因，分析miRNA发挥作用的分子机制，以期从miRNA的角度为LSCC颈淋巴结转移的发病机制、诊断及治疗提供新的实验依据。

喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC）患者的5年生存率在过去25年中并未显著提高，临床上约47%的患者就诊时已经伴有颈淋巴结转移，而这些患者通常预后较差，但迄今为止尚没有一种诊断方法的诊断正确率能够完全满足临床需要。随着分子生物学的发展，很多分子肿瘤标志物被发现，但目前为止没有合适分子肿瘤标记物应用于LSCC的诊断和分级。近年发现的microRNAs（miRNAs，微小RNA）是在一种在进化过程中保守性非常高的非编码RNA，负责转录后水平的调控。近期研究证明miRNA有作为肿瘤分子诊断标记物的潜力。本研究旨在通过miRNA谱学研究，筛选与LSCC颈淋巴结转移密切相关的miRNA，并对阳性miRNA在LSCC浸润转移过程中的作用机制进行研究。.我们利用miRNA芯片在6对LSCC颈淋巴结转移和未转移患者原发灶组织中筛选出了10个差异表达的miRNA，在转移组中其中9个呈高表达，1个低表达，随后用实时定量PCR在40例患者中进行了验证。生物信息学分析表明，筛选出miRNA的靶基因参与调控蛋白质的转录、转录后水平调节、细胞增殖等生物学过程。细胞生物学实验表明，在喉癌细胞系Hep-2中下调 miR-365可明显促进Hep-2细胞凋亡，并抑制细胞周期进程和侵袭力。而过表达或敲减miR-494或miR-143并不能影响细胞凋亡、细胞周期进程和细胞侵袭力。miR-365下游基因编码的蛋白AKT第Ser473、Thr308位磷酸化和ERK的磷酸化可激活肿瘤细胞的增殖和迁移能力，抑制miR-365可下调磷酸化的AKT水平从而抑制喉鳞状细胞癌细胞的增殖和迁移。.目前，国内外尚未有关于LSCC转移相关miRNA的报道，我们筛选出的miRNA具有诊断LSCC的颈淋巴结转移的潜力，这为miRNA成为临床上诊断LSCC颈淋巴结转移的分子标志物提供了理论依据。生物信息学分析发现这些miRNA可能通过调控蛋白质的转录、转录后水平调节、细胞增殖等生物学过程来调节LSCC转移。此外，细胞生物学实验结果表明miR-365可以在体外通过间接调节PI3K/AKT途径促进LSCC的增殖和转移。我们的研究为了解喉鳞状细胞癌颈淋巴结转移分子机制以及临床诊断应用提供了理论基础。