骨桥蛋白介导C-硅橡胶细胞相容性提高的作用及机制

对软组织材料硅橡胶(SR)进行离子注入表面改性,是增强其细胞相容性的有效方式，但改性后通过何种途径介导细胞应答,将理化信号转变为细胞生物学行为,仍有很多未知。前期研究中,我们发现碳离子(C)注入后得到的C-硅橡胶,其细胞相容性增强,但机制不明。近年研究提出,材料吸附体液环境中的蛋白,在表面形成蛋白质层,介导细胞应答。基于此理论和课题组的前期研究,提出:骨桥蛋白(OPN)是在C-硅橡胶表面吸附的一种主要蛋白,作为"桥梁"蛋白,介导C-硅橡胶细胞相容性的提高。本项目拟摸索出适合细胞生长的最佳注入条件,检测其表面性能变化,采用二维电泳＋质谱等方法进一步鉴定明确OPN的"桥梁"蛋白作用，并找出体外培养体系中OPN对MMPs的下游靶分子,并采用构建高/低表达细胞模型的手段进行证实,以探讨其作用机制。为研发有生物功能的新材料提供理论依据,对材料表面性能与细胞生物学行为的关系提供新认识。

软组织填充材料硅橡胶表面性能差，生物相容性欠佳。对(SR)进行离子注入表面改性,是增强其细胞相容性的有效方式，但改性后通过何种途径介导细胞应答,将理化信号转变为细胞生物学行为,仍有很多未知。本研究通过在10eV的条件下，1×1015ion/cm2, 3×1015ion/cm2, 1×1016ion/cm2三种剂量进行离子注入，得到C-SR，采用扫描电镜（SEM）,原子力显微镜（AFM），傅里叶红外光谱（FTIR）,X光电子能谱（XPS）,X射线衍射（XRD）等材料学检测手段对材料表面性能进行评价，发现离子注入改变了材料的表面形貌，同时对材料表面亲疏水性采用水接触角进行检测发现离子注入可以显著提高硅橡胶表面的亲水性，这一提高可能会导致材料表面细胞相容性的增加。通过细胞增殖（CCK-8）细胞粘附(细胞骨架及粘附相关分子免疫荧光染色)以及细胞毒性评价（PI, Hochest 33342双染）发现随着离子注入剂量的增加，细胞的粘附能力增强且C-SR无细胞毒性，1×1016ion/cm2是我们探索范围的最佳改性条件。通过免疫荧光，western-blot，realtime-PCR等实验手段研究了SR，C-SR-1, C-SR-2, C-SR-3四种材料表面细胞OPN的表达及分泌量均显著增加，同时通过抗体阻断实验OPN的抗体可以显著阻断细胞在C-SR表面的粘附，证明OPN在改性材料表面细胞的粘附中占有重要的桥梁作用加入外源性OPN，在体外细胞培养体系中发现MMP9干扰的稳定细胞系粘附性下降的现象可以被外源性OPN所逆转，说明OPN可能是MMP9的上游分子，介导MMP9的表达，提高改性材料表面的细胞粘附，介导改性材料的生物相容性。同时，作为对照材料，补充研究了羟基磷灰石/硅橡胶(HA/SR)和beta-磷酸三钙/硅橡胶(beta-TCP/SR)的表面性能，及细胞相容性。以上研究结果已经明确证实C离子注入可显著提高硅橡胶的细胞相容性，同时OPN的表达量在C-SR表面较普通SR表面显著提高，这种提高起到了介导C-硅橡胶细胞相容性提高的“桥梁”蛋白作用。通过MMP9干扰稳定细胞系的筛选和建立，检测OPN的表达及外源性OPN的补加可以显著逆转MMP9干扰所降低的细胞粘附。