EF-1β调控γ-actin在碳离子注入致硅橡胶细胞相容性提高中的作用机制研究

The interaction between surface property of substrate and cell is the key point of biomaterial research. In our previous study, we found that C ion implantation can improve the biocompatibility of SR. However, the intracellular signal regulation, which can promote adherence and migration of the seeded fibroblasts on C-SR, remains unknown. After analyzing 10 kinds of protein which expressed distinctly in C-SR group by mass spectrogram, western blot and PCR, we found that cytoskeleton protein γ-actin, elongation factor EF-1β and several adhesion molecules expressed increased level according to the amount of implanted C ion. Recent researches elucidate that elongation factor family may participate in the cytoskeleton regulation. So we predicted the biological function of EF-1β and raised the hypothesis that "EF-1β regulates γ-actin can lead to reorganization of cytoskeleton, and improve the cell adhesion and migration of C-SR". In this study, we design to survey the organization of cytoskeleton of fibroblast, and investigate the protein level of EF-1β and γ-actin by western blot and PCR. Besides, CHIP, EMSA and in vitro acetylation system will be introduced to investigate the way of EF-1β regulating γ-actin. Our research will provide theory basis for the development of new biomaterial.

"材料表面特性―细胞"的相互作用是生物材料研究的关键点。课题组前期发现:碳离子(C)注入可有效提高硅橡胶(SR)的细胞相容性,但SR改性后"材料―细胞"界面的变化通过何种细胞内信号途径调节细胞生物学行为尚未阐明。质谱发现碳-硅橡胶(C-SR)表面细胞内有10种蛋白明显变化，WB和PCR验证显示骨架蛋白γ-actin、延伸因子EF-1β和细胞粘附相关蛋白的表达量均随C离子注入剂量增加而提高。结合文献提示EF家族参与细胞骨架调控,我们提出假设:"EF-1β调控γ-actin提高C-SR细胞相容性"。本项目拟系统观察成纤维细胞的骨架变化、EF-1β和γ-actin的表达，建立EF-1β高/低表达细胞模型，阐明EF-1β对γ-actin的调控；利用免疫共沉淀，CHIP等方法，探讨EF-1β对γ-actin的调控方式，并明确是否有EF-1α及其信号通路的参与。为具有生物功能的新材料研发提供理论依据。

本研究系统研究了碳离子注入硅橡胶的细胞相容性和生物相容性较普通硅橡胶改善。.首先观察成纤维细胞在碳-硅橡胶（C-SR）表面的骨架排列，细胞生长以及迁移情况，将碳离子注入硅橡胶分别于室温放置1个月，3个月，6个月取出，成纤维细胞于以上材料表面培养48小时取出免疫荧光染色观察细胞的骨架排列，CCK-8检测细胞生长状况，划痕实验检测细胞迁移情况。从结果可以看出，随着碳离子注入剂量的增加，细胞骨架排列更加规整有序，细胞表现更加铺展，放置时间的延长，细胞骨架的的排列并没有受到大的影响，说明碳离子注入比较稳定，随时间延长并未表现出效果减弱。.其次体内植入实验观察C-SR 的生物相容性，按照中华人民共和国国家标准《医疗器械生物评价》GB/T 16886.6-1997 idt ISO 10993-6:1994 进行体内植入实验。发现随着离子注入剂量的增加，硅橡胶表面组织长入和粘附也越紧，表明C离子注入可以显著改善硅橡胶的表面性能，提高生物相容性。将SR和三种C-SR片植入大鼠背部皮下一月后取出，HE染色，经过染色发现SR周围组织非常致密，随着碳离子注入剂量的提高材料周围组织排列越来越疏松，接近正常组织。MASSON染色发现SR周围组织胶原含量较少，随着碳离子注入剂量的提高材料周围组织胶原含量越来越高，组织粘附也越好。同时碳离子注入时间的延长其生物相容性并未受到显著影响。.然后，对本研究前期质谱所发现的10种蛋白在http:// web. expasy. Org / docs/ swiss - prot 进行结构和功能的验证，发现其中和粘附相关的蛋白有玻连蛋白，ANNIXIN 5，其余蛋白包括GAPDH, PGK1等都属于保守蛋白，其变化和蛋白质的粘附迁移无显著相关性。研究EF-1beta和γ-actin的相互关系，发现随着EF-1beta表达两的增加，γ-actin表达量也呈增加趋势。.作为补充研究，本课题组还研究了羟基磷灰石（HA）涂层硅橡胶表面EF-1beta和γ-actin的相互关系。发现在HA/SR表面EF-1beta和γ-actin呈C-SR表面相似的趋势，同时干扰EF-1beta的表达以后，以前粘附的好的材料表面也表现出较差的细胞粘附，说明了EF-1beta在细胞骨架的重排和细胞粘附中的重要作用。