NS5A/SREBP-1在丙肝病毒相关糖脂代谢紊乱中的作用机制研究

Steatosis and insulin resistance are important clinical manifestations of hepatitis C virus (HCV) infection. However, the precise mechanism underlying this association is still unclear. Recent studies demonstrated that sterol regulatory element binding proteins (SREBPs) may be essential components leading to glucose and lipid metabolism disorder associated with HCV infection. Our previous study has demonstrated that HCV Genotype 3 nonstructure 5A protein (HCV-3a NS5A) activates sterol regulatory element binding protein-1c (SREBP-1c) in Huh-7 hepatocarcinoma cell line and provide a mechanism of steatosis caused by HCV. In this proposal, we will develop a mice model by injection of recombimant HCV-3a NS5A lentivirus particles via tail intravenous which specifically expresses HCV-3a NS5A in hepatocyte, then followed by combining high fat diet with STZ injection. We will use above mice model to study the effect of HCV-3a NS5A on glucose and lipid metablism disorder by regulating SREBP-1a and SREBP-1c. The success of this study will help to reveal the molecular mechanism of HCV associated steatosis and insulin resistance, and it has great significance to explore the prevention and cure strategy of hepatitis C-related diabetes.

肝脂肪变性和胰岛素抵抗是慢性HCV感染者最显著的病理学特征,但相关分子机制尚不清楚,近期报道与脂肪代谢的重要调节因子-固醇调节元件结合蛋白（SREBPs）异常表达密切相关。我们在前期工作中发现3a基因型HCV编码的非结构蛋白5A（HCV-3a NS5A）调节肝癌细胞SREBP-1c的转录，影响其脂肪代谢。本项目在此基础上，应用小鼠肝细胞特异性表达重组NS5A的动物模型，继以不同时间和剂量的高脂饮食结合STZ诱导，在动物、组织和分子水平研究NS5A/SREBP-1对肝细胞糖脂代谢基因表达的影响，初步阐明NS5A/SREBP-1对HCV感染后易继发糖尿病的影响、以及NS5A/SREBP-1对肝细胞糖脂代谢的影响，为HCV相关糖尿病研究提供新的理论依据，为临床提供新的治疗靶点。

近年来众多流行病学调查显示慢性丙型肝炎病毒 (HCV) 感染者中胰岛素抵抗 和 2 型糖尿病的患病率明显高于普通人群和其它原因所致的慢性肝病患者。肝脂肪变性和胰岛素抵抗是慢性HCV感染者最显著的病理学特征，但其相关分子机制尚不清楚。固醇调节元件结合蛋白-1（SREBP-1）是糖脂代谢的重要调节因子。我们在前期工作中发现 HCV 非结构蛋白 5A (NS5A) 通过转录因子 Sp1 调节 SREBP-1 表达，可能与 HCV 感染引起的肝细胞糖脂代谢紊乱密切相关。在此基础上，本项目在普通饲料和高脂饲料不同喂养条件下、应用小鼠肝细胞特异性表达重组NS5A蛋白和NS5A蛋白片段的动物模型，从动物、组织和分子水平研究NS5A蛋白通过抑制腺苷酸活化蛋白激酶 (AMPK)的磷酸化而影响转录因子SREBP-1对肝细胞糖脂代谢基因表达的调节、及高脂饮食对NS5A蛋白调节肝细胞糖脂代谢的作用。本项目通过检测小鼠血糖和血清胆固醇水平，冰冻切片HE染色和油红O染色检测肝组织脂滴形成情况，荧光定量 PCR 检测脂肪代谢的关键酶--乙酰辅酶A 羧化酶 (ACC)、糖异生途径的关键酶--磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPCK) 的表达，免疫组化检测磷酸化AMPK、SREBP-1、ACC、PEPCK 和胆固醇代谢的关键酶--羟甲基戊二酰辅酶 A 还原酶 (HMGCR)，Western blot 检测磷酸化AMPK、SREBP-1、脂肪酸合成酶 (FASN)、PEPCK 和 HMGCR 等指标，初步阐明了：①. NS5A 通过抑制磷酸化 AMPK 的水平，促进 SREBP-1 的表达，使脂肪代谢的关键酶FASN 和ACC、糖异生途径的关键酶PEPCK、胆固醇代谢的关键酶 HMGCR 高表达；②. NS5A domain Ⅱ (aa. 250-355) 通过AMPK/SREBP-1途径调节肝细胞糖脂代谢基因的表达；③. 高脂饮食和NS5A蛋白对肝细胞糖脂代谢具有协同调节作用。本项目初步揭示了NS5A蛋白通过AMPK/SREBP-1途径对糖脂代谢基因的调节作用，为HCV相关糖尿病研究提供新的理论依据，为临床治疗提供新的靶点。