参芪止疱颗粒对TLRs及其信号转导通路影响的研究

本项目采用体外细胞培养技术和建立HSV-Ⅱ感染豚鼠生殖道模型，予以参芪止疱颗粒干预后，应用RT-PCR、ELLISA、流式细胞术、免疫组织化学等方法，检测表皮细胞上各种TLRs-2,3,4,9mRNA的表达情况、豚鼠神经节的潜伏病毒量以及TLRs的下游传导信号基因IRF3和信号传导分泌的细胞因子（IL-1、IL-3、IL-6、IFN-r、TNF -a）的表达变化，并运用电镜观察豚鼠神经节超微结构和HSV-Ⅱ颗粒形态改变的情况。本项目的完成有助于阐明生殖器疱疹的发病机理，以及从体外细胞培养技术和免疫调控的角度阐明参芪止疱颗粒是否可以通过TLRs的信号传导通路增强先天免疫应答，从而明确参芪止疱颗粒治疗生殖器疱疹的作用靶点，为开发预治生殖器疱疹的中药提供了前期基础研究的科学依据。

本课题通过体内外实验，进一步明确生殖器疱疹的发病机理，阐明参芪止疱颗粒治疗生殖器疱疹的作用机制。利用人包皮成纤维细胞（HFF）感染2-型单纯疱疹病毒(HSV-2)，用参芪止疱颗粒予以干预，以阿昔洛韦片（ACV）做对照药，采用CPE法和MTT法进行实验。实验发现HSV-2的TCID50为10 4,参芪止疱颗粒对HFF的CC50值大于10mg/ml，表明其对HFF的毒性作用小；在药物直接抗病毒复制实验中，参芪止疱颗粒对感染细胞EC50为0.30 mg/ml，TI>36表明其对HSV-2感染HFF具有一定保护作用; 在HSV-2感染HFF的治疗实验中，参芪止疱颗粒EC50值为0.60mg/ml，TI>25，提示其对病毒感染后复制有一定的抑制作用；其对HSV-2复制的抑制作用时相主要在感染后0h、2h、4h。建立HSV-2感染豚鼠生殖道模型，用参芪止疱颗粒予以干预，以ACV对照药，采用HE染色、电镜技术、RT-PCR，Western Blot等方法对相关指标进行检测。治疗结束时，参芪止疱颗粒组豚鼠阴道内病毒滴度，外阴皮肤症状与阿昔洛韦组比较差异无统计学意义（P＞0.05），各治疗组与模型组比较有统计学意义（P＜0.05）。参芪止疱颗粒组子宫、输卵管、卵巢组织病理及外阴皮肤组织及脊髓神经节超微结构的改变与ACV组类似。IL-2 mRNA和IFN-γ mRNA表达上调(P＜0.05)，而IL-6 mRNA和TNF-α mRNA、NF-κB mRNA表达下调(P＜0.05)。参芪止疱颗粒组豚鼠给药6h后TLR4 mRNA、MyD88 mRNA表达最强，12h后逐步下降;抑制剂组各时间点TLR4 mRNA，MyD88 mRNA 表达最弱，与其他各组差异有统计学意义(P＜0.05)。研究结果表明：参芪止疱颗粒能起到有效抗HSV-2的作用; 通过调控IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α、NF-κB mRNA的表达,其能减轻HSV-2感染豚鼠子宫、卵巢组织的炎性损害，从而保护机体，达到抗病毒的作用；同时其能有效表达TLR4 mRNA及MyD88mRNA水平，在启动抗病毒的固有免疫反应中起着重要作用。参芪止疱颗粒值得临床推广。