Cas13a/Csm6聚合酶放大电化学SHERLOCK系统的构建及超敏检测肝癌circRNA的研究

Hepatocellular Carcinoma (HCC) is one of the most common malignant tumors, and the development of early diagnosis technology is the key and difficult for its prevention and treatment. In our previous research, we found that traditional detection methods of the miRNAs and lncRNA still have shortcomings such as low sensitivity and poor specificity. Currently studies have confirmed that the circRNA is more specific and stable in tumor tissues than miRNA and lncRNA. Therefore, we would use the circRNA chip to screen and identify the specific circRNAs of HCC. In additional, we would construct a new SHERLOCK detection system. Compared to the traditional detection method, the system of Cas13a nuclease based on sgRNA guide could the precise collateral effect to target of circRNAs, and the detection signal amplification to 10-18 mol/L based on the recombinase polymerase amplification（RPA）of Cas13a/Csm6. In this project, the differential circRNAs of the HCC will be screened. In aditional, the ultrasensitive, highly specific, and fast detection method of electrochemistry SHERLOCK system data will be construct, which is crucial for the fast diagnosis, prevention and control of HCC.

原发性肝癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）是最常见的恶性肿瘤之一，早期诊断技术的滞后是其防治的重点和难点。课题组前期研究发现，目前基于传统检测方法的miRNAs和lncRNA分子诊断方法，依然存在灵敏度低和特异性差等缺点。现有研究证实，circRNA在肿瘤组织中比miRNA和lncRNA更加特异和稳定。为此，本课题拟采用circRNA芯片筛选鉴定HCC的特异性circRNAs，并构建新型肝癌电化学SHERLOCK检测系统。与传统检测方法相比，该系统基于sgRNA 引导的Cas13a核酸酶可以精准侧切割circRNAs分子中的靶向位点；基于Cas13a/Csm6重组聚合酶信号放大方法，可以检测到阿摩尔级（10-18 mol/L）浓度的核酸分子。研究结果将筛选出若干个HCC差异性circRNAs，并为HCC的超灵敏、高特异性早诊早治提供新的策略。

原发性肝癌和肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，早期诊断技术的滞后是其防治的重点和难点。课题组前期研究发现，目前基于传统检测方法的miRNAs和lncRNA分子诊断方法，依然存在灵敏度低和特异性差等缺点。现有研究证实，circRNA在肿瘤组织中比miRNA和lncRNA更加特异和稳定。为此，本课题拟构建应用于肿瘤早期诊断的电化学SHERLOCK检测系统。与传统检测方法相比，该系统基于sgRNA 引导的Casa核酸酶可以精准侧切割circRNAs分子中的靶向位点；基于重组聚合酶信号放大方法，可实现低丰度的核酸分子。研究结果将为肿瘤的超灵敏、高特异性早诊早治提供新的策略。.本研究构建了基于CRISPR/Cas的核酸检测系统，并进行了可行性分析、最佳实验条件优化、灵敏度与特异性等性能验证、临床实用价值分析等研究；进行了CRISPR/Cas反应系统中的Cas12a蛋白酶浓度优化、crRNA浓度优化以及CRISPR/Cas12a反应时间的优化等实验；筛选了能被Cas12a/crRNA特异识别的细胞游离肿瘤DNA，以此为靶核酸，并通过本研究构建的检测平台进行直接检测，无需核酸提取与纯化等实验过程。将该检测平台用于检测临床真实血清样本并与qPCR及DNA测序进行方法学比较。针对肝癌circRNA标志物，设计高特异、高灵敏的RAP引物和探针，建立circRNAs标志物常温快速扩增的RPA技术。.本研究设计并合成了特异识别靶核酸的crRNA，成功建立了CRISPR/Cas12a特异识别裂解靶核酸的检测体系，构建了基于CRISPR/Cas的核酸检测新技术；探索并优化了CRISPR/Cas核酸检测体系中浓度、时间、pH值等最佳反应条件；完成了CRISPR/Cas检测体系对标准品ctDNA的响应特性，包括可行性、灵敏度以、特异性及回收实验；完成了临床真实血清样本的检测；完成了方法学比较，完成了肝癌circRNAs血清标志物的恒温快速检测，评价了CRISPR/Cas的核酸检测新技术的临床应用价值。研究结果将筛选出若干个肝癌差异性circRNAs，并为肿瘤的超灵敏、高特异性早诊早治提供新的策略。.迄今为止，本课题共发表SCI 论著3篇，1篇修回；申请国家发明专利5项；培养博士研究生1名，硕士研究生3名，其中2名已毕业。