联合携PGE2基因骨髓间充质干细胞移植重塑Kuppfer细胞表型诱导大鼠肝移植术后免疫耐受

虽然已有多篇以骨髓间充质干细胞（MSCs）联合移植为基础的肝移植术后成功建立免疫耐受的报道，但MSCs的作用机制并未完全阐明。因此，尚难确定哪种针对MSCs的预处理方式更利于免疫耐受的诱导。最近发现在脓毒症时移植的MSCs主要通过产生PGE2使单核/巨噬细胞重塑为M2型而发挥其免疫抑制效应。而体内70%-80%的单核/巨噬细胞是位于肝脏的Kupffer细胞（KCs）。我们前期工作发现KCs在肝移植后的免疫反应中扮演着双重角色，如重塑KCs为M2型，将促使其功能状态向免疫抑制方向偏移。因而我们推断，增强MSCs重塑KCs为M2型的预处理可能有助于肝移植术后免疫耐受的诱导。本项目拟观察①在肝移植情况下，KCs是否仍是联合移植MSCs发挥免疫抑制效应的主要效应细胞；②过表达PGE2的MSCs能否促进肝移植免疫耐受的诱导，进而为以MSCs联合移植为基础的肝移植免疫耐受的诱导做些探索性工作

我们首先建立了新的简单有效的kupffer 细胞（KC）分离、纯化和培养技术，并对其进行了表型及功能鉴定；此外，我们对比了不同的转染试剂转染RIP140-siRNA至KC的转染效率及细胞毒性，以寻找出最佳的转染方法和条件，进而为本课题基于骨髓间充质干细胞（MSCs）诱导KCs表型改变的的细胞实验奠定了良好的基础。我们从细胞实验角度进行了以下研究：（1）MSCs对KCs表型的影响；（2）过表达PGE2的MSCs对KCs表型的影响；（3）抑制KCs IRF-3的表达对联合培养诱导的免疫耐受的影响。我们发现，在LPS等因素刺激下，KCs通过TLR4-TRAM-TRIF途径释放的TNF-α与MSCs表面的TNFR结合，刺激MSCs上调NF-κB，进而激活COX-2，诱导PGE2的合成及释放；而由MSs分泌的PGE2则与KCs表面的EP2及EP4受体结合，形成分子信号环形通路，最终重塑KCs为M2型巨噬细胞，从而大量释放IL-10，达到免疫抑制效应。在这一环形通路中，早期KCs激活释放的TNF-α是重要的触发因子，而经MSCs释放的PGE2，是关键的桥接因子。活体动物实验部分：我们建立了DA鼠→Lewis鼠原位肝移植模型，将对象随机分为四组 ：A组，肝移植术后经门静脉注射生理盐水；B组，肝移植术后注射MSC细胞；C组，供体术前注射氯化钆以特异性抑制KCs活性，术后注射MSC细胞；D组，肝移植术后注射Ad-PGE2-MSC细胞。我们证实，MSCs可以通过释放PGE2诱导KCs从M1型向M2型转变；KCs通过释放TNF-α引导MSCs归巢并释放PGE2；MSCs和KCs两种细胞间的相互作用促成了大鼠肝移植术后免疫耐受的形成，同时过表达PEG2能使MSCs的免疫调节作用更加明显。我们还发现，虽然KCs过度激活是导致移植肝脏缺血再灌注损害的重要原因，但移植肝脏的再生还极大的依赖于KCs上的肝细胞再生增强因子的表达，KCs功能完全抑制的小体积肝移植术后大鼠生存率并不能得到提高；而以RIP140shRNA抑制KCs的RIP140表达后将通过抑制NF-KB活化，重塑KCs为M2表型，下调 TNF-α，有效减轻大鼠肝移植术后IRI的程度。因此，本项目结果提示：在肝移植这一特殊特病理环境下，诱导KCs为M2表型，不仅有利于术后免疫耐受的建立而且还能减轻缺血再灌注损害。