新型5α-还原酶抑制剂干扰血-附睾屏障后附睾腔液蛋白的筛选鉴定研究

目前超过50%男性不育患者的发病原因不明，开展男性不育的发病机理研究十分必要。附睾作为精子成熟的器官，它的功能异常可以引起男性不育，目前国内外这方面的研究还在起步阶段。我们前期研究发现新型5α-还原酶抑制剂度他雄胺可以干扰大鼠血-附睾屏障和精子成熟，引起大鼠不育，但不影响睾丸精子生成。而血-附睾屏障发生异常后，有可能引起精子成熟相关附睾腔液蛋白和精子膜蛋白的改变。基于此本项目拟利用双向电泳结合二维反向色谱和质谱蛋白质组学技术，分析鉴定度他雄胺作用大鼠和正常大鼠附睾管腔液蛋白和精子膜蛋白的差异，并对有功能的差异蛋白进行定性、定量和定位分析，结合生物信息学分析，初步建立药物影响附睾精子成熟的蛋白表达谱数据库。该研究将有助于揭示精子在附睾中成熟的分子机理，为解决精子成熟异常所引起的不育症提供分子水平的信息，为男性不育诊断和治疗提供新的药靶位点，也为研发新型阻断精子成熟的男性避孕药物提供设计思路。

我们前期研究发现新型双重5α-还原酶抑制剂度他雄胺可以干扰大鼠血-附睾屏障和精子成熟，引起大鼠不育。本研究（1）首先通过度他雄胺诱导雄性大鼠不育药效学研究，建立了药物诱导大鼠附睾不育模型及其评价体系。包括CASA分析附睾精子活力和形态；合并使用透射电镜技术对各组附睾尾部精子进行透射电镜分析，评价度他雄胺对大鼠精子成熟的影响；采用SYBR-14和PI双重荧光染色计算精子存活率；采用Elisa法测定大鼠睾酮（T）和双氢睾酮（DHT）血清浓度，评价度他雄胺对雄鼠雄激素水平的影响；采用HE染色法对各组睾丸、附睾进行组织学分析，同时采用透射电镜技术对附睾上皮细胞超微结构进行分析。这为今后不育治疗和男性避孕药物研究提供了动物模型及参考。（2）通过透射电镜分析附睾细胞紧密连接变化， RT-PCR分析度他雄胺组和对照组附睾上皮连接蛋白Claudin1和β-catenin基因表达变化；免疫组化和免疫印迹分析其蛋白表达变化，结果度他雄胺显著抑制雄性大鼠生育，与其降低大鼠血清DHT水平，进而抑制附睾上皮连接关键基因Claudin1和β-catenin表达和破坏附睾上皮紧密连接有关。（3）通过双向电泳结合二维反向色谱和同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术，经过样品制备、SDS-PAGE电泳检测、FASP酶解、LC-MS质谱分析，结合BLAST2GO、David和KEGG蛋白功能分类软件对差异蛋白进行了分子功能、生物过程和细胞组分功能分类和信号通路分析，分析鉴定了度他雄胺作用大鼠和正常大鼠附睾管腔液的差异蛋白。结果从附睾腔液4239个unique peptide中鉴定出蛋白组1040个，根据蛋白显著差异标准（＞1.5或＜0.66，同时P＜0.05），度他雄胺显著影响的附睾腔液蛋白共23个，其中上调16个，下调7个，其中7个显著下调的蛋白中有3个是β防御素家族成员，有可能是度他雄胺影响附睾腔精子成熟和雄性生育力的关键所在。该研究将有助于揭示精子在附睾中成熟的分子机理，为男性不育诊断和治疗提供新的药靶位点，也为研发新型阻断精子成熟的男性避孕药物提供设计思路。