附睾蛋白酶抑制剂的基础和临床研究

Eppididymal Protease Inhibitor (Eppin) is a protein with serine protease inhibitor-like structure, which is secreted specifically by male mammalian testis and epididymis. Now there are only little studies about the functions of Eppin on male mammalian reproductive system. Few researches have suggested that Eppin maybe be involved in semen liquefaction and sperm motility. However the exact roles and molecular mechanism remained unclear. In our previous studies, we have identified an Eppin protein complex from the surface of human spermatozoa. These several proteins in the complex have been proved to play important roles in the regulation of semen liquefaction and sperm motility. Based on previous studies, we will produce specific Eppin monoclonal antibody, research the interaction and characteristic of Eppin with key proteins during semen liquefaction in vitro; analyze the expression difference of gene and protein of Eppin between two spermatozoa groups with different motility; observe sperm motility incubated with anti-Eppin antibody and detect the changes of key materials (such as Ca2+、ATP and cAMP) after the incubation of spermatozoa with antibody. Our study will be beneficial to reveal the roles and molecular mechanism of Eppin during the regulation of semen liquefaction and sperm motility, find new etiology and diagnostic and therapeutic methods, which have important basic research and clinical value.

附睾蛋白酶抑制剂（Eppin）是雄性哺乳动物睾丸和附睾特异性分泌的一种具有丝氨酸蛋白酶抑制剂样结构的蛋白质。目前关于Eppin在雄性生殖系统中功能的研究不多。少数研究提示Eppin可能与精液液化和精子活力调控有关，但是其具体作用和分子机制仍不明确。前期研究中我们在人类精子表面鉴定出Eppin蛋白，并发现Eppin与几种目前已知的参与精液液化和精子活力调控的蛋白质形成蛋白复合体。在此基础上，我们将制备Eppin单克隆抗体，体外研究Eppin与精液液化过程中的关键蛋白的相互作用及作用特点；分析Eppin在活力不同精子中的基因和蛋白表达差异；利用Eppin抗体孵育人类精子，观察其对精子活力的影响，检测与活力相关的Ca2+、ATP、cAMP等关键物质变化。我们的研究有助于揭示Eppin在精液液化和精子活力调节过程中的作用及分子机制，发现弱精子症新的病因和诊疗方法，具有重要的基础研究和临床应用价值。

本研究中我们进一步研究了纤维连接蛋白（Fibronectin，Fn）和Eppin之间的关系以及Fn在精子表面的分布定位。Fn结合在Eppin的氨基端，并与Eppin互作共同存在于精子头部顶体后区和中段区域，为精子在女性生殖道中受精做准备。PSA能够水解精囊凝固蛋白（Semenogelin I，SgⅠ）调控精液液化，我们研究中发现Eppin能够特异性的抑制PSA的活性，并且呈现出剂量依赖性。我们推测，Eppin，SgⅠ和Fn三者的相互作用，通过调控PSA的活性参与精液凝固液化的过程中。此外，随着研究的深入，我们发现SgⅠ蛋白在肾癌组织中呈现低表达，且有统计学意义。临床病理学方面，SgⅠ蛋白高表达的患者肿瘤分期比较低（P<0.0001），且预后较好，肿瘤复发比较低（P<0.0001）。我们从细胞层面进一步研究SgⅠ参与肾癌发生发展中作用机制。设计载体质粒过表达SgⅠ蛋白，利用慢病毒构建肾癌稳转细胞系（Sg-1-786-0, NC-786-0, Sg1-ACHN, and NC-ACHN）。研究发现，与对照组相比，过表达SgⅠ蛋白能够明显抑制细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并且促进肿瘤细胞发生凋亡。在寻找调控信号通路过程中，我们通过western blot技术发现MAPK/JNK的磷酸化水平明显增加；同时与细胞侵袭能力相关蛋白MMP9表达明显增高。由此表明SgⅠ参与肾癌细胞一系列肿瘤生物学行为与MAPK/JNK信号通路有关，过表达SgⅠ蛋白导致JNK磷酸化水平增高；同时我们加入JNK抑制剂sp600125，发现肾癌细胞的侵袭能力受到抑制。此外，我们通过实时定量PCR和免疫组化实验发现在精囊炎患者精囊组织中，SgⅠ蛋白的表达明显比正常精囊组织要低，SgⅠ蛋白参与精囊炎的发生分子机制的研究也是后续研究的一个新的方向。