从 miRNA34a/SIRT1/p53 通路介导肝细胞衰老研究脂肪性肝纤维化的分子机制与木瓜苷的干预作用

In recent years, fatty liver disease has become one of the main causes of liver fibrosis, but the mechanism of fatty liver fibrosis has not been fully elucidated, and also the lack of effective therapy. According to a recent study, senescent cells have secretory activity of inflammatory factors, while miR-34a, SIRT1 and P53 gene expression is closely related to senescence, but the relationship between miR-34a/SIRT1/p53 signal pathway and fatty liver fibrosis has not been studied; glucosides of Chaenomeles speciosa has good anti-inflammatory activity, hepatic protective effect, and also has good therapeutic effect on fatty liver disease, but the molecular mechanism remains to be elucidated. This project aims to establish fatty liver fibrosis animal model and hepatic senescence model, using immunofluorescence, flow cytometry technique to study in molecular mechanism of senescence and inflammatory factor in fatty liver fibrosis, and application of siRNA, gene transduction methods to research miR-34a/SIRT1/p53 pathway mediated hepatic senescence. And we will investigate the intervention effect of glucosides of Chaenomeles speciosa on miR-34a/SIRT1/p53 pathway and hepatic senescence, and explore the pathogenesis and intervention mechanism of glucosides of Chaenomeles speciosa in fatty liver fibrosis. It will provide a new area for the prevention and treatment of fatty liver fibrosis.

近年来，脂肪性肝病已成为肝纤维化发生的主要原因之一，但脂肪性肝纤维化的发生机制尚未完全阐明，亦缺乏有效的干预措施。近期研究显示，衰老细胞具有分泌炎性因子活性，而miR-34a、SIRT1和p53基因表达与细胞衰老密切相关，但miR-34a/SIRT1/p53信号通路与脂肪性肝纤维化发生的相关性尚未研究；木瓜苷具有良好的抗炎活性与护肝效应，对脂肪性肝病亦有良好的防治作用，但其分子机制仍有待阐明。本项目拟在建立脂肪性肝纤维化动物模型与肝细胞衰老模型基础上，先采用免疫荧光、流式细胞术等方法研究脂肪性肝纤维化中肝细胞衰老及炎性因子分泌，再应用siRNA、基因转导等技术研究miR-34a/SIRT1/p53通路在介导肝细胞衰老中的作用，以及木瓜苷对miR-34a/SIRT1/p53通路与肝细胞衰老的干预作用，进而探讨脂肪性肝纤维化的发病新机制与木瓜苷的干预机制，为脂肪性肝纤维化的防治提供新思路。

本项目获得如下研究成果，一）细胞水平建立肝细胞衰老模型 (1)游离饱和脂肪酸棕榈酸（PA）可诱导肝细胞衰老，衰老相关基因P53、P21表达增加，Cdk2、Cdk6及 Sirt1的表达降低，miR-22及SASP炎性因子表达上调。（2）应用高糖高脂（PA+葡萄糖）也可以诱导衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）表达增加，miR-34a、Ac-P53、P21、Rb1及γH2AX表达增加，CDK4/6表达下调。（3）瞬时转染miR-34a或 miR-22mimics后，衰老相关的SA-β-Gal、Ac-P53、P21、Rb1及γH2AX表达增加；miR-34a 或 miR-22 inhibitor、p53 siRNA或SIRT1激动剂干预后，均可逆转衰老相关基因表达表达。二）在动物水平研究发现高脂饮食的BALB/c小鼠表现为（1）体重、肝重、附睾脂肪重量增加，肝甘油三酯含量上调等脂质沉积的表现；H&E染色显示肝脂肪变性，脂代谢异常的脂肪性肝病表现。（2）衰老相关β-半乳糖苷酶及衰老相关蛋白增加；免疫荧光染色显示在HFD组 P53表达增加、SIRT1在核的表达下调；qPCR显示在HFD组miR-22、miR-34a等表达增加和Sirt1表达降低；小鼠血清中炎性因子IL6、TNF的蛋白表达明显增高。（3）应用慢病毒及脂质微泡载miR-34a Inhibitor或p53siRNA、SIRT1基因进行NAFLD的干预作用。三）木瓜提取物改善NAFLD活性。（1）应用不同方法提取木瓜，并应用绿原酸等作为质量控制标准进一步研究提取物活性。 (2) 木瓜30%醇洗脱液（CSE）改善PA的脂毒性，增加SIRT1的表达，降低miR-34a、P16、P21表达。(3) CSE改善脂质在肝细胞的沉积。(4) 动物实验显示CSE可以明显改善NAFLD小鼠胰岛素抵抗（糖耐量实验），降低模型小鼠血糖血脂及转氨酶水平。(5) HE染色、油红O染色显示CSE可以降低模型小鼠肝脂肪变性，及降低脂代谢相关基因ACC-1、LXR、ACSL、ChREBP表达。(7) 降低模型小鼠肝细胞β-Gal阳性细胞数量，及降低衰老相关基因P21、P53表达；降低其炎性因子TLR-4及内质网应激相关Grp78、CHOP基因表达。这些结果提示miR-34a / SIRT1 /p53 信号通路在肝细胞衰老中具有重要调控作用，