阻断THPO/MPL信号通路调控"成骨细胞龛"屏蔽龛内白血病细胞功能的研究

成骨细胞龛对造血干祖细胞和白血病细胞的支持作用是维持正常造血和白血病恶性克隆持续存在的关键。成骨细胞龛THPO/MPL信号通路与龛内造血干祖细胞静止期的维持密切相关，髓系白血病细胞MPL的高表达及其与白血病不良预后的相关性也提示THPO/MPL信号通路可能是维持白血病细胞静止期，并最终导致白血病难治与复发的关键。本课题拟在构建成骨细胞龛3D模型的基础上，首先研究白血病成骨细胞龛中THPO/MPL的表达以及对白血病细胞细胞周期及周期调控分子表达的影响；然后通过化疗干预，研究THPO/MPL信号通路在成骨细胞龛屏蔽白血病细胞中的作用；通过单克隆抗体技术和RNAi阻断THPO/MPL通路，研究阻断该信号通路后对静止期白血病细胞的影响以及相关的调控机制，最后通过联合化疗药物干预研究清除龛内白血病细胞的可行性。本课题为针对白血病骨髓微环境治疗白血病提供新的思路。

摘要：. 目的:本研究主要研究目标拟通过在构建白血病成骨细胞龛模型的基础上，研究成骨细胞龛通过TPO/C-MPL、GCSF等信号通路调控白血病细胞增殖、凋亡及其耐药特性的作用及机制。方法：首先，我们采用ELISA法和流式细胞术测定急性髓系白血病初治患者化疗前、化疗缓解后及急性髓系白血病复发患者骨髓TPO的表达以及c-MPL的表达率。然后分离培养人（白血病患者）骨髓间充质干细胞，并诱导成骨细胞分化，分别构建成骨细胞-白血病细胞二维培养模型和以生物衍生骨为基础骨架的三维共培养模型。在构建共培养模型的基础上，分别检测正常和白血病成骨细胞龛对白血病细胞增殖、凋亡以及对DNR化疗屏蔽的影响。最后，构建了TPO的RNAi载体，转染成骨细胞稳定阻断TPO表达后，观察其对龛内白血病细胞功能的影响。同时设计了GCSF预激实验，通过对龛内白血病细胞进行GCSF预激后，观察白血病增殖、粘附及耐药的变化。结果：1. AML复发及初发患者骨髓单个核细胞c-MPL均有较高表达，明显高于对照组(P<0.05)，复发患者c-MPL表达明显高于AML初发患者水平（P<0.05）；初发患者化疗缓解后可降至正常水平(P>0.05)。2．ELISA法检测发现AML初发患者骨髓上清TPO表达水平高于对照组(P<0.05)，AML复发患者明显高于初发患者(P<0.05)，初发患者化疗缓解后与正常骨髓TPO表达无明显差异(P>0.05)。3．骨髓间充质干细胞成骨诱导过程中TPO表达逐渐增多，同一诱导时相点AML骨髓诱导的成骨细胞表达水平高于正常骨髓诱导的成骨细胞(P<0.05)，成骨细胞株hFOB1.19细胞体外培养能够分泌TPO。5．白血病成骨细胞与白血病细胞共培养后其在化疗药物（DNR）的处理下的IC50明显高于正常成骨细胞组和白血病单独培养组。6、G-CSF预激后，能够促进成骨细胞龛-白血病细胞共培养体系内的白血病细胞进入细胞周期，提高对化疗药物的敏感性。同时加速其凋亡。结论：白血病成骨细胞龛能够起到对龛内白血病细胞的促增殖、粘附作用和屏蔽化疗杀伤作用，成骨细胞的高TPO水平和白血病细胞C-MPL表达对于维持成骨细胞龛内白血病细胞增殖、粘附、耐药特性起到重要作用，通过靶向抑制TPO/C-MPL通路以及G-CSF预激可以削弱成骨细胞龛的屏蔽作用，上述调控为通过改造骨髓微环境治疗白血病提供了思路。