体内以DNA为中心的互作蛋白的鉴定与定量方法学研究

DNA-protein interaction plays a key role in the regulation of cellular functions such as DNA replication and reparation, gene transcription, and etc. All the existing methods such as chromatin immunoprecipitation (CHIP), DNA affinity chromatography, electrophoretic mobility shift assay (EMSA), surface plasmon resonance (SPR), yeast one-hybrid assay have limitations to identify all the components involved in the in vivo interactions with a given DNA region and quantify the in vivo interaction dynamics simultaneously. In this study, we design a powerful plasmid, harboring protein tag for affinitive purification and relative quantification. In combination with high-end mass spectrometry technology, our method can identify and quantify all the proteins which interact with the given DNA fragment in vivo. We take the well-known diaminopimelate decarboxylase gene promoter as example to evaluate and optimize our method. The final goal of this method is to break down the limitation of the existing methods, provide a scalable tools to identify all the components of the proteins interacting with any certain DNA region in vivo, and at mean while provide the key information such as occupancy ratio of the proteins on the DNA region. The successful establishment of this method will largely strengthen the global understanding of DNA-based biological regulations.

DNA与蛋白质因子的相互作用是DNA复制与修复、基因转录调控的重要基础。目前已经发展的体内体外DNA与蛋白质互作研究方法不能有效地富集鉴定与给定DNA相互作用的蛋白质，难以了解参与调控的全部蛋白组分和动态调控机制。针对这一问题，本项目设计了一种特殊工具质粒，携带亲和纯化和蛋白质相对定量标签，结合高分辨质谱技术，可针对任意给定目标DNA序列，鉴定体内与其发生相互作用的蛋白质分子并实现相对定量。本研究以转录调控机理较清楚的大肠杆菌二氨基庚二酸脱羧酶lysA基因启动子为例对方法进行优化。最终目标是突破以往转录调控研究方法的局限，鉴定体内生物环境下与任意给定DNA区域发生相互作用的蛋白质因子单体、蛋白质复合体所有成分，定量分析给定DNA区域与每种蛋白的结合比率，从而全面解析给定DNA序列的动态调控行为，为深入理解生命体生理调控机制奠定基础。

DNA和蛋白相互作用对于解析细胞生理调控过程，响应胞内外环境因素具有重要意义；本项目的研究目标，一是要建立能够实时j鉴定生理状态下与胞内任意特定DNA相互作用的未知蛋白的方法，二是要能够检测这种未知蛋白随环境变化而发生的与DNA的体内动态相互作用。根据第一个研究目标，构建了利用LacI-3*Flag钓取连接在lacPO3-mut核酸片段上的待分析DNA片段及其互作蛋白的体系，以赖氨酸合成关键酶二氢吡啶二羧酸还原酶基因dapB启动子作为待分析DNA片段，对体系进行了大量优化，获得了能够与dapB基因启动子区域相互作用的两个新的蛋白。该方法能够实时鉴定生理状态下与胞内任意特定DNA相互作用的未知蛋白，对于人们认识细胞代谢调控过程具有很大帮助。在研究第二个目标时发现蛋白与DNA的体内动态相互作用非常复杂，而且这种作用比较弱，很容易被背景信号掩盖，无法准确对互作蛋白进行相对定量，因此，项目在研究过程中进行了部分调整，加入了一部分细胞响应环境中小分子浓度的研究，以赖氨酸和苏氨酸小分子为例，首先通过转录组分析和文献调研等手段获得能够响应赖氨酸的邻氨基苯甲酸合成酶组分I的基因启动子pA，能够响应苏氨酸的亚硫酸盐还原酶β亚基cysI基因启动子和3'-磷酸腺苷酰硫酸还原酶cysH基因启动子的融合启动子pcysJIH，在启动子的下游连接荧光蛋白基因eyfp作为信号，从而将细胞的赖氨酸或苏氨酸浓度与荧光信号偶联，通过流式细胞仪筛选能够高产赖氨酸或苏氨酸的突变体，实现氨基酸生产菌株的快速提升，通过该方法的应用，一株赖氨酸高产菌株的产酸和糖酸转化率分别提高了21%和9%，一株苏氨酸高产菌株的产酸和糖酸转化率分别提高了5%和18%。该项目发展的方法具有通用性，理论上可以用于大部分高价值化学品生产菌株的快速提升。