叶酸受体靶向的吴茱萸碱对严重创伤后继发性器官损害的保护作用机制研究

严重创伤后继发性器官损害可致MODS的发生，而过度活化的巨噬细胞(Mф)释放炎症介质及对凋亡/坏死细胞清除能力的降低贯穿了该病理过程。我们前期观察到吴茱萸碱(EVO)可明显逆转该变化，结合活化Mф高表达叶酸受体(FR)的特点，成功合成叶酸-EVO (FE)并发现其对创伤+内毒素攻击小鼠死亡率的降低作用优于EVO。本项目拟首先明确FE对活化Mф调节作用有赖于FR介导的内化效应；从Mф的AhR核移位、凋亡、自噬活性及相关分子变化探讨其作用机制；通过小鼠足趾炎症、腹膜炎模型证实FE在炎症病灶部位的靶向分布及其对活化Mф功能的特异调节；再通过创伤+内毒素攻击小鼠模型，验证FE对器官功能损害程度、持续时间的干预效果；探索性研究FE对病灶部位Mф由促炎向促修复表型转变的影响。研究结果将有助于揭示FR靶向的EVO对严重创伤后继发性器官损害的保护作用机制，并为降低MODS发生的新型免疫调节剂研发奠定基础。

严重创伤后继发性器官损害可致 MODS 的发生, 而过度活化的巨噬细胞释放炎症介质及对凋亡／坏死细胞清除能力的降低在该病理过程中发挥重要的角色。我们前期观察吴茱萸碱（EVO)可明显逆转该变化。基于活化的巨噬细胞高表达叶酸受体的特点，我们设计并合成了叶酸-EVO，靶向定位于巨噬细胞而发挥作用。本项目的研究内容主要包括1）证实叶酸-EVO对炎性巨噬细胞的功能调节并研究所涉及的分子机制；2）在酵母多糖或是脂多糖诱导的腹膜炎模型中评价叶酸-EVO对机体炎症反应的抑制作用以及对脏器功能的保护作用。本项目首先证实新合成的叶酸-EVO溶解度是EVO的40倍，并且仅抑制叶酸受体高表达的Hela细胞的增殖，而对静息状态的RAW264.7细胞（叶酸受体低表达）无影响，表明叶酸-EVO发挥作用需要叶酸受体的介导，这正符合当初我们的设计理念。之后我们检测叶酸-EVO对炎性巨噬细胞炎症因子分泌的影响，发现其对IL-6、TNF-α、IL-10蛋白表达起到明显的抑制作用，通过机制研究发现EVO一方面可通过抑制下调IκBα磷酸化水平，阻止IκBα蛋白的降解，进而阻抑NF-κB p65入核来发挥抗炎效应；另一方面显著降低细胞总AhR的蛋白含量以及AhR与Stat1的结合，进而抑制核蛋白与NCE以及非共有序列DRE的结合活性。在动物实验中，结果显示叶酸-EVO可下调酵母多糖所诱导的腹膜炎中血清炎症因子的高峰值，同时对肾脏和心脏的功能损害具有缓解效应。然而在脂多糖诱导的急性腹膜炎中，叶酸-EVO的保护效应并不明显，其中所涉及的原因可能是由于叶酸-EVO拥有比EVO大3倍的分子量，从而导致药物无法被机体及时吸收。因此下一步本课题组还需要对叶酸-EVO的结构实施进一步的优化。本项目顺利完成预期的目标，叶酸-EVO的成功合成以及药效和分子机制的研究，不仅有助于揭示以叶酸受体为靶向的EVO对多器官功能损害的保护作用机制，并为降低MODS发生的新型免疫调节剂研发奠定基础。本项目已发表 SCI论文1篇，会议论文摘要2篇，申报国家发明专利2项。