钙离子内流诱发的钙释放参与血肿瘤屏障动态开放中的机制

我们前期的体外实验结果证实小剂量缓激肽可以选择性启动大鼠C6胶质瘤细胞内钙离子内流诱发的细胞内钙库释放，这可能是缓激肽选择性开放血脑肿瘤屏障的内在基础。细胞内钙库中Ca2+的释放与回收在细胞多方面功能调控中起着重要的作用，对于细胞信号的传导和信号功能的定位有非常重要的意义。本项目在体外Transwell血肿瘤屏障模型上，拟首先探讨胶质瘤细胞与毗邻脑血管内皮细胞之间可能的信号传递过程，并进一步通过对脑血管内皮细胞上紧密连接相关蛋白和跨细胞转运相关蛋白的表达、分布和定位等方面的研究，明确细胞内钙库参与血肿瘤屏障动态开放的内在机制。本项目能够进一步阐明钙离子内流诱发的钙库释放参与血肿瘤屏障动态开放过程的分子机制，通过本项研究必将为寻找潜在的、特异性更高的能选择性开放血脑肿瘤屏障的靶点指引方向，为脑胶质瘤及中枢神经系统疾病寻找新的治疗靶点。

缓激肽是高分子量激肽原的产物，由血管内皮细胞的的舒血管素-激肽系统的生理激活，将激肽释放酶原裂变为激肽释放酶而形成的。缓激肽小剂量(10µg/kg/min)经颈动脉灌注入大鼠脑胶质瘤模型，与对照组生理盐水相比较可以显著地增加胶质瘤内血管的通透性，然而颈动脉灌注缓激肽并未影响正常脑组织内的血管通透性。因此此项实验的在于探讨是否缓激肽诱发的钙触发钙释放现象（calcium-induced calcium release，CICR）存在于大鼠原代脑微血管内皮细胞；是否CICR现象参与到紧密连接蛋白claudin-5的表达当中，后者是组成哺乳类动物血脑屏障的主要的构成部分，并且发挥决定性作用。为了进一步阐述缓激肽调节紧密连接蛋白claudin-5的分子机制，我们成功地建立了大鼠脑微血管内皮细胞（rat brain microvascular endothelial cells，BMECs）原代培养。10-5 M的缓激肽刺激BMECs前后，细胞内钙离子荧光变化由钙离子荧光敏感性探针Fluo-3测定；紧密连接蛋白claudin-5的表达以及内质化研究由免疫荧光和免疫印迹技术测定。研究结果显示，在原代大鼠脑微血管内皮上并不存在缓激肽功能型B2受体，与此同时新鲜的脑组织中结果也阴性。我们经过研究发现10-5 M的缓激肽能够触发BMECs产生钙离子波，即细胞内钙离子变化，进一步的研究显示内质网的IP3及尼诺丁受体参与到上述的钙离子变化中。因此，应用缓激肽后，这些典型的内皮细胞内钙离子变化可以被称为CICR现象。免疫荧光以及免疫印迹结果表明缓激肽可以使紧密连接蛋白claudin-5表达明显下降，此外还可以调节claudin-5的内质化和重新分布；内质网IP3和尼诺丁受体激动剂IP3和咖啡因协同缓激肽进一步下调claudin-5的表达，内质网IP3和尼诺丁受体阻断剂2-APB和尼诺丁可以阻止或部分阻止缓激肽对claudin-5的影响。我们因此可以得出结论：缓激肽诱导脑微血管内皮细胞产生的CICR可能为缓激肽调节紧密连接蛋白claudin-5及体外血肿瘤屏障通透性的分子机制。