基于杂交链式反应和三阶校正的转录因子高灵敏荧光检测新方法研究

This project work is aimed to be a contribution to the development of simple, rapid, stable, reliable and label-free homogeneous methods for highly sensitive and selective fluorescence detection of transcription factors. Herein, the hybridization chain reaction technique is initially introduced as the signal amplification tool to design these bioassays, in the combination with a new strategy of eliminating background signals via high-order calibration. More specifically, a transcription factor model analyte is firstly added to induce the conformational change of its corresponding capture DNA probe and thus, trigger DNA sequence is released from this probe to initiate the hybridization chain reaction of two types of hairpin DNA probes. Highly sensitive fluorescence detection of the target analyte can be subsequently realized by aptamer mediated fluorescence enhancement of malachite green or DNAzyme catalyzed fluorescence production of substrate as the secondary signal amplification. More importantly, the background signals can be eliminated by two new third-order calibration algorithms. The proposed novel technologies are expected to conquer a series of problems existing to varying degrees in the current bioanalytical methods for transcription factor detection, including low detection sensitivity, complicated and time-consuming labelling procedures, relatively high intrinsic background signals and limited analysis capability in complex biological samples. Thus, they may hold great potential for forwarding the practical applications of transcription factor in a wide spectrum of fields, such as biomedicine (particularly the early diagnosis of diseases and the development of new drugs), proteomics, genomics, and so on.

本项目拟首次将杂交链式反应信号放大技术引入转录因子检测平台的设计，并结合三阶校正算法，开展高灵敏、简单、快速且适于复杂生物样品分析的转录因子免标记均相荧光检测新方法研究。先利用转录因子模型分析物诱导DNA捕获探针构型转换，以释放触发DNA序列用于启动两种发夹型DNA探针的杂交链式反应，并佐以核酸适配体介导孔雀石绿荧光增强、DNA过氧化物酶催化荧光底物等级联信号放大手段，进而借助两种三阶校正新算法的“数学分离”功能，高效消除背景信号和生物基质内源性干扰及基体效应的影响，实现对目标物的高灵敏荧光检测。由此构建的转录因子检测新方法，可望解决现有方法不同程度存在的分析灵敏度较低、修饰及标记过程繁琐费时、背景信号难以消除、复杂生物样品分析能力有限等一系列问题，对于推动转录因子在生物医学（特别是疾病诊断与新药开发）、蛋白质组学、基因组学等领域的实际应用研究具有十分重要的理论价值和现实意义。

发展高性能化学与生物传感新方法和新技术对于医学诊断、环境分析、食品安全等领域意义重大。本项目原计划利用杂交链式反应结合酶催化反应建立高效信号放大新机制，同时开发新型高阶校正算法，开展灵敏、特异的TATA结合蛋白等转录因子荧光分析新方法研究。本项目在实施过程中基本按照预定计划进行。例如，成功建立了基于杂交链式反应结合葡萄糖氧化酶催化反应的信号放大新策略；开发了基于单向不完全扩展形式四线性成分模型的交替拟合加权残差四线性分解（AFWRQLD）新算法，并用于实现复杂样品中感兴趣目标物的无干扰直接荧光分析。此外，根据实验中出现的新问题与相关领域国际前沿最新进展，经上报批准后对部分研究计划与内容作了适当的调整和补充。例如，针对孔雀石绿荧光增强效果不佳、DNA过氧化物酶催化底物信号产生不理想、TATA结合蛋白等转录因子标准品不易购买、荧光仪出现软硬件问题等，及时调整采用杂交链式反应结合经典葡萄糖氧化酶催化反应等思路实现信号高效放大，同时以人癌基因蛋白、干扰素蛋白、药物小分子等作为靶标，并巧妙引入血糖仪、笔式pH计等作为替代性信号量测手段。此外，鉴于发展免仪器定量分析策略正成为化学与生物传感领域的研究热点之一，深入开展纸芯片制备及其便携式分析应用研究，并探索建立了基于酶催化反应介导纸体颜色改变、纸体亲水性-疏水性转换、液体粘度调控或胶体丁达尔效应等机制的测距、计时、计数等若干种免仪器定量分析新策略，用于发展一批液相或基于纸芯片的免仪器定量分析新方法。尤其是，创立了具有独特可视化定量分析优势的二维液相比色分析新理论。所取得的系列研究成果具有较好的创新性。在Analytical Chemistry、Chemical Communications、Biosensors and Bioelectronics等化学、分析化学与传感器领域公认的国际顶级或重要科技期刊发表16篇高质量学术论文。此外，申请国家发明专利8项，其中获得授权5项。本项目发展的化学与生物传感新原理、新方法与新技术，可望为后续开发具有潜在商业化应用前景的分析新平台、新器件和新设备提供有益的新思路。