新型蛋白CkND在棉花抗病中的功能及其调控分子机理解析

棉花黄萎病已成为制约棉花产量提高和品质改善的主要障碍，为培育棉花抗病品种奠定理论基础，申请者已经利用蛋白组学策略从荒漠植物-牛心朴子草中分离出抗病新蛋白CkND，CkND对棉花黄萎病菌菌丝生长以及孢子萌发具有显著地抑制作用，转35S::CkND基因拟南芥植株生长良好，抗病性增强。.申请者拟构建CaMV35S启动子控制的CkND基因超表达和RNAi抑制表达载体，把载体导入农杆菌，以新陆早33为受体进行棉花遗传转化，对CkND表达水平变化的转35S::CkND和35S::CkND RNAi植株进行研究，分析棉花与Verticillium dahliae 亲和性表型、病害症状发展与CkND转录激活水平变化，揭示黄萎病菌侵染过程中CkND蛋白水平的动态变化以及CkND表达量与棉花抗病性的关系。采用微观机制与宏观表型相结合，不同组织与整体对抗病响应相结合，解析新蛋白CkND抗棉花黄萎病的机理。

棉花黄萎病、枯萎病已成为制约棉花产量提高和品质改善的主要障碍，为提供抗病基因资源和培育棉花抗病品种奠定理论基础，2011-2013年研究小组利用蛋白组学策略从荒漠植物-牛心朴子草分离纯化抗病新蛋白CkND（CkTLP），蛋白CkND对黄萎病菌菌丝生长抑制效果为87.50％，对孢子萌发抑制率为100%，对棉花黄萎病菌和枯萎病菌具有显著抑菌活性。为了研究新型蛋白CkND在棉花抗病中的功能及其调控分子机理，根据nano-ESI-MS/MS测定4个肽段的氨基酸序列，克隆出CkND基因（GenBank NO：GU067481）。CkND基因在ABA、SA、MeJA、NaCl和干旱胁迫下，CkND转录激活水平显著提高。CkND基因通过农杆菌介导法分别转入拟南芥和棉花（品种为新陆早33），证实CkND基因整合到拟南芥、棉花基因组中，且稳定表达。CkND∷GFP融合蛋白定位于拟南芥细胞壁。棉花黄萎病菌侵染植株30d后，转CkND基因拟南芥比野生型拟南芥的发病率降低42.7%；转CkND基因棉花（F2代）比野生型棉花的发病率降低62.9%，7d后转基因棉花与黄萎病菌亲和性表型降低，非转基因棉花病害症状加重。在病圃2年试验表明，转CkND基因棉花对黄萎病菌表现出高水平抗性，通过单遗传控制黄萎病菌生长，异核不亲和性的菌丝体死亡，异核体不亲和性是一个受CkND基因调控的过程。CkND蛋白含有酸性凹槽和疏水表面可能是CkND蛋白抑菌活性位点。构建牛心朴子草cDNA文库，通过酵母双杂交系统检测到CkND和CkANN两种蛋白相互作用，通过研究发现CkND和CkChn134具有协同作用导致黄萎病菌和棉花的不亲和性反应。把CkND和CkChn134基因的双价载体pZZZ-CkND-Chn转入棉花（新陆早33），转双价基因棉株抗黄萎病菌和枯萎病的能力高于转单价基因棉花植株抗病能力。CkANN通过调控过氧化物酶的活性，诱导PR-1、Chn134和葡聚糖酶基因的表达，获得转基因棉花黄萎病、枯萎病的高抗性。揭示了抗病蛋白相互作用的途径，抵抗棉花黄萎病菌菌丝的扩展，最终控制棉花黄萎病、枯萎病。结果表明CkND蛋白不仅直接抑制病原菌菌丝的生长和孢子萌发，而且在转基因棉花中CkND基因调控植株对棉花黄萎病、枯萎病抗性。