共分子伴侣BAG3蛋白PXXP结构域相互作用蛋白的筛选与功能解析

共分子伴侣BAG3通过其PXXP结构域促进自噬性降解变异蛋白及蛋白聚集体、调控肿瘤细胞迁移侵袭的研究引人注目，但具体分子机制不清。PXXP结构域是经典的蛋白质相互作用模体，通过与含SH3等结构域的蛋白质相互作用，介导细胞信号转导、细胞内蛋白的定位与隔离等多个过程，揭示BAG3可能通过其PXXP结构域与某（些）蛋白质相互作用而调节自噬及肿瘤细胞的迁移和侵袭等。目前唯一鉴定出的与BAG3蛋白PXXP结构域相互作用的蛋白质是PLC-gamma1，而PLC-gamma1敲除对选择性自噬和肿瘤细胞侵袭等均无明显作用，表明BAG3可能通过PXXP结构域与其它未知蛋白相互作用而调控自噬及肿瘤侵袭。本项目拟筛选并鉴定与BAG3 PXXP结构域特异性相互作用的蛋白质，阐明BAG3调控选择性自噬，调节肿瘤细胞运动、迁移及侵袭的可能分子机制。

项目的背景：BAG3具有调控细胞凋亡、存活、细胞周期进展、分化、细胞自噬等多种重要的生物学功能，其功能的多样性可能归功于BAG3蛋白分子含WW、PxxP、BAG多个蛋白相互作用结构域。BAG3可能通过这些结构域与许多分子相互作用，从而决定了BAG3分子的功能多样性。因此，从整体水平解析BAG3的相互作用蛋白组，有利于进一步了解BAG3分子的生物学功能及其可能的分子作用机制。.主要研究内容：.（1）.BAG3相互作用蛋白组学的筛选和鉴定.（2）.BAG3与GRP78相互作用的功能解析.（3）.BAG3与G6PD相互作用的功能解析.研究结果：本项目采用SILAC和蛋白质谱技术对BAG3相互作用蛋白组进行了筛选，筛选出一批尚未报道的BAG3相互作用蛋白质，并对其中的一些相互作用蛋白进行了验证。本项目对其中的两个相互作用蛋白GRP78和G6PD与BAG3的相互作用进行了深入解析。首先，本项目通过co-IP、GST pulldown、DuoLink PLA等多种手段证实了BAG3与GRP78、G6PD的直接相互作用，并通过截短型表达载体，鉴定出BAG3通过其BAG结构域与GRP78的ATPase结构域相互作用。鉴于某些分子与GRP78的ATPase结构域结合后，有利于procaspase-7从GRP78分子的解离及其随后的活化，我们解析了BAG3与GRP78相互作用对procaspase-7活化的影响。本项目发现BAG3与procaspase-7竞争性结合GRP78，促进DNA损伤剂诱导的procaspase-7活化及肿瘤细胞对DNA损伤剂的敏感性。而针对G6PD的解析，鉴于G6PD是磷酸戊糖途径（PPP）的关键酶，而PPP对于肿瘤细胞的增殖存活非常重要，我们解析了BAG3与G6PD相互作用对肝癌细胞的影响。本项目发现BAG3抑制G6PD的二聚体形成及其活性，抑制PPP和肝癌细胞增殖。并且，本项目进一步证实BAG3通过抑制G6PD而抑制PPP和肝癌细胞增殖。.科学意义：通过BAG3与GRP78相互作用的解析，本项目提示在BAG3高表达肿瘤患者的化疗中，含DNA损伤类化疗药物的化疗方案可能具有较好的治疗效果。.通过BAG3与G6PD相互作用的解析，本项目提示BAG3可能在肿瘤糖代谢重编程中发挥重要功能，可能为进一步理解肿瘤代谢重编程提供基础。