蛋白激酶C delta（PKCd）介导BAG3蛋白S187位点磷酸化的解析

作为一种凋亡调控分子，BAG3与Hsp70、Bcl-2、PLC gamma等相互作用，在多个水平参与肿瘤细胞增殖、运动、迁移、侵袭、肿瘤耐药性等行为的调节。作为PKC家族的一员，PKC delta在细胞的生长、分化、凋亡、肿瘤进展、肿瘤耐药性中发挥非常重要的作用。但PKC delta在信号转导中的作用及生理性的酶作用底物等方面研究甚少。我们的前期成果首次表明PKC delta与BAG3结合并且在S187位点磷酸化BAG3，但BAG3磷酸化的生物学意义尚不清。本项目拟明确S187磷酸化对BAG3调控肿瘤细胞存活、运动、迁移及侵袭等行为的影响及其可能的分子机制。本项目将加深我们对BAG3上游调控信号以及PKC delta的生理性酶作用底物的理解，加速我们对BAG3及PKC delta在肿瘤发生、进展以及耐药等方面机制的理解，对于寻找新的药物靶点具有非常积极的意义。

本项目鉴定出BAG3是PKCdelta的新磷酸化底物，并且明确了PKCdelta在Ser187位点磷酸化BAG3。PKCdelta介导BAG3的Ser187位点磷酸化对BAG3与Bcl-2，HSP70的相互作用无明显影响。为了解析BAG3磷酸化的功能，本项目构建了模拟磷酸化S187D型和阻碍磷酸化S187A型变异BAG3表达载体，构建了野生型WT、S187A和S187D型BAG3稳定过表达甲状腺癌FRO细胞，发现BAG3的磷酸化状态调节FRO细胞的形态，S187A-BAG3使细胞更趋于上皮型，而S187D-BAG3使细胞更趋于间质型。实时定量PCR、Western blot以及细胞免疫荧光证实S187D-BAG3增加间质细胞标志分子，而降低上皮细胞标志分子的表达；而S187A-BAG3增加上皮细胞标志分子，而降低间质细胞标志分子的表达。这些结果表明BAG3参与FRO细胞的上皮-间质转化（EMT）过程，其中S187位点的磷酸化状态发挥了关键作用。划痕修复、转移小室等结果表明S187D-BAG3促进FRO细胞的运动、迁移及侵袭，而S187A-BAG3抑制FRO细胞的运动、迁移及侵袭。本项目首次鉴定出BAG3具有调节甲状腺癌细胞的EMT功能，并且PKCdelta介导的Ser187位点磷酸化状态在其中具有重要作用。