Calpains对机械通气膈肌萎缩的影响及其机制

蛋白分解加剧是机械通气膈肌萎缩的主要原因。我们前期研究发现泛素蛋白酶体途径在其中发挥了作用。新近研究表明，钙蛋白酶系统通过与泛素蛋白酶体的协同作用，并抑制蛋白合成信号通路的关键酶苏氨酸激酶（Akt）的活性，参与蛋白降解过程。但具体机制不明。据此，我们首先观察钙蛋白酶抑制剂对裂解骨架蛋白后的片段、泛素蛋白连接酶关键组分、热休克蛋白90，及在肌萎缩过程中Akt信号通路各组分表达的影响。进一步以Ca2+刺激C2C12肌管增加钙蛋白酶活性后，观察肌管大小、泛素蛋白连接酶组分及Akt 活性的变化。最后在Ca2+刺激肌管同时分别以蛋白酶抑制剂、胰岛素刺激和质粒转染上调Akt水平后观察上述作用的逆转。以阐明机械通气条件下钙蛋白酶作用于泛素蛋白酶体上游协同蛋白降解，并影响Akt活性进一步促进蛋白降解和肌萎缩。本课题有助深入了解机械通气膈肌萎缩的发生机制，并为选择钙蛋白酶开发成抗肌萎缩的药物提供理论依据。

蛋白分解加剧是机械通气膈肌萎缩的主要原因。我们前期研究发现泛素蛋白酶途径（UPP）在其中发挥作用，但机制不明。研究表明，钙蛋白酶系统（calpains）与UPP协同作用参与蛋白降解过程，并影响Akt肌肥大通路导致肌萎缩。据此，我们首先观察钙蛋白酶抑制剂calpeptin对机械通气大鼠膈肌超微结构，肌球蛋白重链（MHC）浓度，calpain活性，UPP关键组分MAFbx和MuRF蛋白表达的影响；进而观察以Ca2+或钙+calpeptin或钙+蛋白酶体抑制剂bortezomib刺激C2C12肌管后的大小面积， talin肽段蛋白水平，calpain活性，MAFbx和MuRF蛋白和mRNA水平，Foxo1和Foxo3a蛋白和mRNA水平，总的Akt和磷酸化Akt蛋白，总GSK-3β和GSK-3β磷酸化蛋白水平，及Akt与HSP90亚型蛋白结合体的变化。发现：1. calpains在机械通气膈肌损伤中发挥了促进作用，损伤的特点和部位与calpains分布及功能密切相关；2. calpains参与机械通气大鼠膈肌萎缩的调节作用，通过作用于UPP上游调节肌纤维蛋白降解。calpains抑制剂逆转肌萎缩及增高的calpains活性和MAFbx 和MURF1蛋白水平。3. 成功制备C2C12肌管，肌管形成过程中的相关基因表达。4. 阐明calpains 调节C2C12肌管萎缩，其机制通过拆分骨架蛋白而后UPP得以降解蛋白；两条途径同步调节肌萎缩机制也存在。予C2C12肌管钙或者钙+钙蛋白酶抑制calpeptin或钙+蛋白酶体抑制剂bortezomib 处理后，C2C12肌管变细，平均面积减少，予calpeptin或者bortezomib处理后，此改变恢复等。5. 阐明calpains也通过对Akt–mTOR–GSK-3β信号通路的反向影响调节肌萎缩。科学意义：本研究阐明：calpains在肌萎缩和肌损伤中发挥促进作用，其机制通过作用UPP上游与其协同降解肌纤维蛋白，同时，calpains与UPP两条途径也同步调节肌萎缩。另外calpains通过Akt–mTOR–GSK-3β信号通路反向调节影响肌萎缩。本课题明确证实了calpians在肌肉蛋白降解和肌萎缩中的促进作用及其发生机制，为开发机械通气抗肌萎缩的靶点药物提供了充分的理论依据。