大蜂螨(Varroa destructor)精氨酸激酶基因的克隆与功能分析

Varroa destructor is the worst enemy of honey bees, it is currently thought to be one of the mainly causes of Collony Collpase Disorder(CCD). So far, the understood of the molecular biology in Varroa destructor was not clear. Arginine kinase (AK) is the only phosphorylase kinase and plays an important role in the energy metabolism in phylum arthropoda. In this project, the AK gene will be cloned from Varroa destructor by RACE, the genomic and protein sequences will be analized with genomic walking and bio-informatics technologies, and the expression of AK gene will be identified in different tissues, different stage and different stimulations by RT-PCR and FISH. In addition, the effects of RNA interference (RNAi) on the energy metabolism in Varroa destructor will be conducted with the double stranded RNA that are designed from the functional region of the AK. As a result, this project will explore the molecular mechanism of energe metabolism, energe storage and energe utilization for Varroa destructor. And it will offer the foundational data to the further researching of functional genes in Varroa destructor. Furthermore, it will contribute to studies of coevolution between varroa mites and their hosted honey bees, mite-resistence genes hunting in honey bee, bio-controlling of varroa destructor based on RNA interference. Thereby, it will contribute to the protection of the global honey bee colonies.

大蜂螨(Varroa destructor)是养蜂业的头号大敌，近年来被认为全球蜂群数量急剧下降的主要原因之一，其遗传背景研究非常薄弱。精氨酸激酶（Arginine Kinase,AK）是节肢动物体内唯一的磷酸原激酶，在能量代谢过程中发挥着重要的作用。本项目拟采用RACE技术和基因步移法分别获得大蜂螨精氨酸激酶基因和基因组序列，应用生物信息学方法对其启动子等调控元件进行分析；同时应用RT-PCR和FISH技术检测AK在大蜂螨不同组织中的分布情况和不同发育时期及不同应急下的基因表达模式；最后从能量代谢系统出发，研究RNA干扰大蜂螨AK基因对其生长发育及繁殖的影响。本项目的开展将从分子水平阐明大蜂螨能量代谢、储存和利用的调节机理，同时为大蜂螨功能基因组研究、蜂螨与蜜蜂协同进化及蜜蜂抗螨基因筛选等研究提供重要数据，为下一步开展RNAi控制蜂螨危害研究奠定基础，进而为全球蜂群的保护作出应有的贡献。

作为模式动物，蜜蜂是地球上最重要的授粉昆虫，在生态平衡、农业发展和科学研究中都起着至关重要的作用。大蜂螨(Varroa destructor)是威胁全世界养蜂业的头号大敌，被认为近年来全球蜂群数量急剧下降（Collony Collapse Disorder, CCD）的主要原因之一，给养蜂业及相关领域带来了灾难性的影响。精氨酸激酶是节肢动物体内唯一的磷酸原激酶，在能量代谢过程中发挥着重要的作用。本项目采用RACE技术克隆了大蜂螨精氨酸激酶基因(Varroa destructor Arginine kinase, VdAK)，其cDNA全长为1493bp，ORF编码325个氨基酸，蛋白分子量为39.82 KDa，预测等电点为5.79。利用蛋白质功能位点分析软件应用生物信息学方法对基因和表达蛋白序列分析结果显示：位于VdAK氨基酸序列中的6个氨基酸CPTNLG是精氨酸激酶的活性中心部位，其中半胱氨酸是其必须的活性位点。VdAK与已报道的精氨酸激酶序列比对，相似度在60~90%之间。检查大蜂螨不同组织、不同发育阶段及不同应急情况下VdAK的表达模式发现：35oC的成年雌螨表达量最高；不同组织和不同发育阶段之间没有显著差异。在VdAk活性中心部位设计双链RNA(dsRNA)片段，通过显微注射于成年雌螨中发现：与注射GFP dsRNA的对照组相比，RNA干扰VdAK基因对大蜂螨的生长发育没有直接关系，但严重影响繁殖率。本项目首次从分子水平阐述大蜂螨能量代谢、储存和利用的调节机理，同时为大蜂螨功能基因组研究提供重要的基础资料，在蜂螨与蜜蜂协同进化、抗螨基因筛选、RNAi控制蜂螨危害等研究中具有重要的意义。