小菜蛾精氨酸激酶基因的克隆及其RNAi研究

通过RACE技术克隆小菜蛾精氨酸激酶的全基因序列，并应用生物信息学软件分析小菜蛾精氨酸激酶的基因结构和功能；体外合成小菜蛾精氨酸激酶基因的dsRNA，添加dsRNA到饲料中喂食小菜蛾，研究小菜蛾精氨酸激酶基因的表达和小菜蛾的生长发育，明确喂食dsRNA对小菜蛾精氨酸激酶基因表达的抑制作用和该基因抑制对小菜蛾生长发育的影响；构建表达小菜蛾精氨酸激酶基因dsRNA的转基因植株，研究小菜蛾取食转基因植物后精氨酸激酶基因的表达和小菜蛾的生长发育，明确通过转基因植株表达的dsRNA对小菜蛾精氨酸激酶基因表达的抑制作用和转基因植物对小菜蛾生长发育的影响，并获得高抗性的植株。研究结果将从理论上为利用RNAi技术进行害虫控制的可行性上提供新的证据，技术上为昆虫上实现RNAi提供具体方法。同时该研究可为利用RNAi技术控制小菜蛾以及其它害虫打下基础，具有广阔的应用前景。

小菜蛾Plutella xylostella是十字花科植物重要害虫。精氨酸激酶（Arginine Kinase，AK）是昆虫生命活动过程中与能量代谢有关的的关键性酶，对该基因正常表达的抑制将会影响到昆虫的生长发育，是RNA干扰控制害虫的很好靶标。本研究克隆了小菜蛾精氨酸激酶基因的cDNA全长序列，用体外合成和转基因植物生成两种手段获得该基因部分序列的双链RNA（dsRNA），通过喂食导入小菜蛾体内，检测其对小菜蛾精氨酸激酶基因表达的抑制情况，以及对小菜蛾生长发育的影响。主要结果如下：. 采用同源克隆的方法设计保守引物，得到586 bp的序列，再通过RACE获得精氨酸激酶cDNA全长1342 bp。该基因包含一个完整的开放阅读框(1068 bp），编码356个氨基酸。通过相关的生物信息学分析，在核苷酸水平上，精氨酸激酶基因全长cDNA序列与家蚕、野蚕、棉铃虫、美洲大蠊精氨酸激酶基因分别有94%, 93%, 85%和 82%的同一性；在氨基酸水平上，精氨酸激酶与家蚕、野蚕、棉铃虫、美洲大蠊精氨酸激酶的氨基酸序列分别有94%, 94%, 92% 和86%的同一性。. 选择了小菜蛾的AK基因cDNA全长中含有AK活性位点基序的318 bp（AK1）和不含有该活性位点基序的339 bp(AK2)两个片段，利用体外转录体系试剂盒合成相应的dsRNA，喂食小菜蛾二龄幼虫。同时，以相应的cDNA片段和ddH2O作为对照。结果表明，dsRNA对小菜蛾的生长发育具有显著影响，cDNA片段和ddH2O都没有影响，其中AK1的dsRNA比AK2的dsRNA效果更为明显。. 构建AK1的dsRNA植物表达载体，获得4株转基因植株。用转基因植株喂食小菜蛾幼虫，两天左右即有幼虫死亡，随着取食时间的增加，死亡率增大。与对照相比，转基因植株喂饲的幼虫存活率为56%，雌虫的平均产卵数为67%，卵孵化率为52%。同时，AK在小菜蛾体内mRNA积累量明显减少，这与直接喂食dsRNA的试验结果是一致的。与直接喂食dsRNA相比，用转基因植株产生dsRNA效果更稳定，解决了体外合成dsRNA不易保存的难题，是一种更有潜力的昆虫RNAi方法。. 本研究表明基于精氨酸激酶基因的RNA干扰技术有望发展为一种新的小菜蛾控制方法，也为其它害虫的控制提供借鉴。