GATA4 C末端缺失增强心肌细胞凋亡影响心脏室间隔发育的信号转导机制

Our previous mutational screening on patients with congenital ventricular septum defects (VSD) identified 7 mutations in GATA4 gene, of which, p.S335X pre-terminates the translation of GATA4, producing a truncated GATA4 that lacks exon 5-6 at c-terminus, referred as to GATA4-(ex5-6). We further demonstrated that GATA4-(ex5-6) presented a decreased affinity with its cis-elements and promoted apoptosis by suppression of bcl-2, an anti-apoptotic factor. In this proposal we intend to investigate the underlying mechanism in primarily cultured neonatal cardiomyocytes and transgenic mouse models. We specifically study 1) how GATA4-(ex5-6) triggers mitochondria apoptotic pathway, 2) through transcriptome sequencing, comprehensively seeking for the signaling molecules associated with GATA4-(ex5-6)-related apoptotic pathway, 3) how exon 5-6 affect the affinity and stability of its binding to cis-element, and 4) how GATA4-(ex5-6) causes VSD in vivo transgenic mouse model.

我们前期在先天性室间隔缺损（VSD）患者中发现并报道了7 个GATA4突变，其中p.S335X产生终止密码导致外显子5-6（Ex5-6）缺失。C端缺失的GATA4降低DNA结合力、抑制Bcl-2表达而促进心肌细胞凋亡，但机制尚不清楚。本课题拟以乳鼠心肌细胞和转基因小鼠模型研究：1）确定C末端缺失的GATA4诱导的细胞线粒体凋亡相关途径的信号通路分子；2）表达谱测序系统筛选和鉴定C末端缺失的GATA4调控心肌细胞凋亡的新的信号转导途径；3）探讨GATA4C末端影响DNA稳定性的机制；4）研究缺失C末端的GATA4对转基因小鼠心脏室间隔发育的分子机制。明确GATA4C末端增强心肌细胞凋亡影响心脏室间隔发育的机制，为探讨先天性心脏病临床产前分子诊断提供新的靶点。

本项目旨在研究GATA4突变p.S335X导致GATA4 C末端缺失后诱导心肌细胞凋亡的作用，揭示GATA4调控心肌细胞凋亡的分子机制，为先天性心脏病的临床诊治提供新的靶点。本课题组基于空载体（pcDNA6）成功构建了GATA4野生型（WT）和p.S335X突变型（MU）过表达质粒，使用P19和H9C2细胞构建过表达细胞培养模型，验证GATA4的过表达，并对细胞在正常状态和细胞因子刺激状态下的凋亡情况进行了评估。为了进一步研究其作用机制，我们以分子生物学手段检测了GATA4 WT和MU对经典凋亡信号通路Akt/Foxo/Bcl2家族的影响，发现GATA4 WT可通过调节经典凋亡信号通路Akt/Foxo/Bcl2家族，减少细胞凋亡，该作用依赖于GATA4 C末端的功能；此外，借助qPCR array技术，我们筛选出了部分差异表达的基因，结果提示GATA4对心肌细胞凋亡的作用可能还涉及p53、PDK1/PKC/Bcl10、MAPK8（JNK）/Jun、Gadd45α等多个途径。本研究的结果揭示：GATA4 C末端可能通过作用于经典凋亡信号通路Akt/Foxo/Bcl2家族，和p53、PDK1等多个信号途径，抑制心肌细胞凋亡，而p.S335X突变可能通过导致GATA4 C末端缺失，使心肌细胞凋亡增加，最终影响心脏室间隔发育。