CRISPR/Cas9在大动物神经疾病模型脑中的安全性与疗效

CRISPR/Cas9 has become a powerful tool for gene editing in a variety of cell types and different species. It can be expressed via AAV and stereotaxic injection in selective brain regions to target specific genes in neuronal cells. We recently found that injection of AAV vectors expressing CRISPR/Cas9 to knockout the huntingtin (HTT) gene in Huntington disease (HD) mice can remarkably reduce HTT accumulation as well as aggregates and also improve mouse motor function. However, because of the lack of robust and obvious neurodegeneration in transgenic rodent models of HD and other neurodegenerative diseases such as Alzheimer disease (AD) and Parkinson disease (PD), it would be difficult to use transgenic rodent models to evaluate the therapeutic effects of CRISPR/Cas9 on neurodegeneration. Recently, we also established HD knock-in (KI) pigs that can recapitulate the selective neurodegeneration in the HD brains. However, it remains unknown whether Cas9, a large bacterial protein, can induce any immune response or cytotoxicity, which may affect its capacity to cut DNAs, in the central nervous system of large animals. To minimize the potential toxicity of the prolonged expression of Cas9, we generated a new version of Cas9 (Ubi-Cas9) with a short half-life. We propose to use stereotaxic injection of AAV-Cas9 and AAV-Ubi-Cas9 into the HD KI pig brain and then test the effects of these two types of Cas9 on knocking out the HTT gene and to examine their potential neuronal toxicity. We will also examine whether adult pig neurons are still able to clear the pre-existing HTT aggregates. These studies will help the future clinical use of CRISPR/Cas9 to treat a number of neurodegenerative diseases.

CRISPR/Cas9可通过AAV病毒载体在大脑神经细胞中表达而修饰靶向基因。我们曾发现脑注射AAV-Cas9病毒载体敲除Huntington disease (HD)基因后可改善基因修饰HD小鼠的运动功能。然而，Cas9作为一个大的细菌蛋白在高等哺乳类大动物中枢神经系统中的可能毒性及治疗作用尚未有报道。我们曾对Cas9加以改造而获得一种具有高效基因编辑能力但可较快降解的Cas9（Ubi-Cas9）。我们还建立了能高度模拟HD病人脑中神经细胞死亡的HD敲入knock-in(KI)猪模型。本项目中，我们将比较Cas9和Ubi-Cas9在HD KI猪脑中的基因编辑及敲除HTT的能力，可能出现的免疫反应与神经毒性，以及对HD KI猪脑中病理变化及动物行为学的作用。

亨廷顿病 (Huntington disease, HD)为典型的神经退行性疾病。目前尚无有效的治疗方法。虽然HD小鼠模型可以模拟变异HTT（mHTT）蛋白的累积、包涵体的形成以及部分临床症状，然而HD小鼠模型的脑中并没有表现出明显的神经细胞死亡。 此缺陷阻碍了对神经细胞死亡治疗效果的严格评估。我们前期工作获得HD突变基因敲入(KI)的猪模型。分析这些HD KI 猪发现它们出现了与HD病人极为相似的运动障碍,行为异常及早期死亡。 更为重要的是, HD KI猪模型能模拟HD 病人脑中典型的选择性神经细胞死亡这一重要特性, 而这一重要特性在HD 小鼠及其它动物模型都不出现。 因此， HD KI 猪所表现的明显表型与神经细胞死亡给我们提供了－个理想的模型来寻找治疗神经退行病的有效方法与措施。. 由于mHTT可以影响细胞内多种功能, 公认的有效治疗方法是阻断 mHTT的表达。对于像HD这样由于单基因突变造成的疾病，理想的措施是把突变的基因剔除掉。CRISPR/Cas9 介导的基因编辑是永久性的，可有效抑制体内 mHTT 的表达。然而， CRISPR/Cas9介导的基因治疗在大动物体内的安全性有待于研究。Cas9作为一个大的细菌蛋白，其过表达可能对大动物的神经系统会产生特异的免疫反应或毒性而影响它对基因编辑的能力。因而十分有必要检测CRISPR/Cas9在大动物脑内是否能有效地进行基因编辑以及其安全性。. 本研究通过直接注射AAV病毒载体在成年猪⼤脑的纹状体表达CRISPR/Cas9从⽽在神经细胞修饰靶向基因。我们验证了AAV病毒载体的表达效率。同时，我们也将AAV病毒载体注射到新生猪的静脉中，发现AAV病毒载体能够很好的表达在大动物中枢大脑神经内部。同时我们也观察到，AAV-Cas9的表达并不明显影响猪的大脑神经细胞。AAV-CRISPR/Cas9的表达也未引起明显的神经炎症及免疫反应。更重要的是，AAV-CRISPR/Cas9 能有效地降低mHTT的表达水平，减少神经细胞变性死亡的程度及改善HD KI 猪模型的运动功能。由于猪与人类更接近，本课题的研究对治疗HD疾病具有重要意义，其结果对今后治疗⼀⼤类神经退⾏疾病(AD, PD 等)也具有广泛及重要的指导意义。