利用CRISPR/Cas9技术建立人类ALS细胞疾病模型并应用于发病机制的研究

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a common motor neuron disease mainly caused by the degeneration of spinal motor neurons, and its pathological mechanism is still unclear now. iPS technology still has some unsolved problems like the interference of external factors, the difference of gene background when establishing human disease specific cell models of ALS. We utilized known technologies in pluripotent stem cell culture and differentiation and gene editing and basically developed a simple human ALS cell model to avoid the above disadvantages of the iPS cell model. The result of a preliminary experiment indicated that the expression of the important protein Rab7 which regulates cell autophagy had decreased in this disease model, while the abnormal protein aggregation was one of the main mechanism that caused the degeneration of dynamoneures. Therefore, we speculate that the mutation of SOD1 causes the decrease and activation barrier of protein Rab7, which will then lead to abnormal cell autophagy and caused pathological aggregation of SOD1. In this paper, we will utilize the latest molecular biology, immunology, gene engineering technology to prove that the decrease and activation barrier of protein Rab7 cause abnormal autophagy of dynamoneures, and will discuss its protective effect at cellular level and overall level through over expression of protein Rab7. The result will be useful for the correct understanding of the effect of protein Rab7 on the degeneration of human ALS dynamoneures, and will provide new targets for its treatment.

肌萎缩侧索硬化（ALS）是一种运动神经元疾病，主要由脊髓运动神经元退行性变导致，其发病机制仍未明确。iPS技术在构建ALS人类疾病特异性细胞模型方面还存在着外源因素的干扰、基因背景差异等问题。我们利用已掌握的多潜能干细胞培养分化和基因编辑技术，初步构建了一种SOD1突变的人类ALS细胞疾病模型，试图规避iPS细胞模型的上述缺陷。预实验结果发现模型中调节细胞内自噬清除的重要蛋白Rab7的表达减少，而蛋白质的异常聚集是导致运动神经元变性的重要机制之一，我们推测Rab7减少和活化障碍导致了模型中运动神经元自噬清除障碍，引起蛋白病理性聚集。本课题将运用最新的分子生物学、免疫学、基因工程等技术证实上述假设，并通过过表达Rab7活性形式，在细胞和整体水平探讨其保护作用。结果将有助于正确理解Rab7在人类ALS运动神经元退行性变中的作用，同时也为其治疗提供新的靶点。

肌萎缩侧索硬化（ALS）是一种常见的运动神经元疾病，主要由脊髓运动神经元退行性变导致，其发病机制仍未明确。iPS技术在构建ALS疾病特异性细胞模型方面还存在着外源因素的干扰、不同病人间的基因背景差异等问题。本研究通过利用CRISPR/Cas9技术将D90A突变的SOD1基因、野生型SOD1基因和GFP对照基因转入人类胚胎干细胞系（hESC H9）的AAVS1开放位点，使其稳定表达相关基因，并向运动神经元分化，成功的获得了所需的运动神经元细胞，达到了后期检测所需的细胞量和纯度。我们用电镜检测多次重复均未发现模型中运动神经元出现明显的自噬障碍，利用双荧光mRFP-GFP-LC3 腺病毒转染技术，因转染运动神经元效率过低，未能检测到自噬通量的障碍。分析原因可能与转入SOD1 D90A突变基因的人胚胎干细胞中正常的SOD1基因干扰了D90A突变基因的作用，同时，自噬调节蛋白Rab7可能并不存在活化障碍，为此我们敲除了转入SOD1 D90A突变基因的人胚胎干细胞中正常的SOD1基因，消除干扰，在基因敲除后药物筛选的过程中，为了获得纯合子克隆，挑选过程中要不断进行测序，挑选纯化克隆，最后得到了完全纯化的基因敲除克隆并向运动神经分化进行后续检测。同时，我们又构建了携带有SOD1 A4V全显性基因的胚胎干细胞系并向运动神经元分化，并对其自噬是否存在障碍及可能的机制进行检测。ALS细胞疾病模型的一大应用就是用来筛选药物，我们利用人SHSY-5Y细胞株转入ALS致病基因筛选出SecinH3可以通过改善自噬通量和内质网应激反应起到保护作用，为在人类ALS细胞疾病模型进一步筛选治疗药物提供基础。