C-反应蛋白的胞内折叠、组装及质控机制研究

C-reactive protein (CRP) is one of the most widely used marker of inflammation in the clinical practice, whose serum concentration can increase up to 1000-fold in response to inflammatory stimuli. CRP is a secretory protein composed of five identical, non-covalently associated subunits with no glycosylation modification. However, little is known how CRP folds and assembles, which underlies its efficient cellular secretion. Our preliminary experiments demonstrate that the folding and assembly of CRP in live cells appear to follow a predetermined, stepwise pathway with obligatory intermediates, in which the relation between conformation folding and disulfide bonding depends on specific folding stage. This project thus aims to delineate the dynamics by which the secondary structure motifs are assembled into the native structure in live cells and identify the quality control mechanisms underlying the cellular folding, assembly and secretion of CRP. The project will further screen for the conformation-locked mutants to guide the design of animal model experiments to establish the exact activities of CRP in specific conformations in the regulation of inflammation.

C-反应蛋白（CRP）是最常用的临床炎症标识之一，其血浆浓度在炎症条件下可升高上千倍，但决定细胞高效合成、分泌CRP的机制未知。CRP由五个相同的亚基构成，每个亚基内仅含一个二硫键，无糖基化修饰，且可由大肠杆菌正确表达，这暗示CRP的折叠、组装很可能主要由其自身序列特征指导。然而，CRP在离体条件下不能自发复性，提示胞内环境对于其天然结构的形成是必要的。我们的前期工作发现CRP亚基的胞内折叠、组装似乎遵循一条预定的分步途径，在不同阶段中构象折叠和二硫键形成互为驱动，且依赖于不同二级结构元件的折叠和装配。在此基础上进一步阐明CRP的合成、分泌动态及质控，不但能够推进对细胞高效产生CRP机制的理解，而且有助于为蛋白质折叠分子过程的解析提供范例，并为回答折叠研究中的若干争议提供线索。在此基础上，本项目还将进一步设计构象锁定突变体，以澄清不同（中间体）构象形式CRP在动物模型中的确切炎症调控活性。

蛋白质折叠是生物学的基本问题，但相关理论模型主要基于对可在胞外自发折叠的、小尺寸模式蛋白的研究。C-反应蛋白（C-reactive protein, CRP）是一种典型的人类急性期因子，由五个分子量为23 kDa的相同亚基通过非共价相互作用组装而成，其天然结构形成需要胞内环境。本项目以CRP为范例，发展了表征CRP胞内结构状态的实验手段，刻画了CRP在细胞内进行亚基折叠及五聚体组装的途径及质控机制，推进了对CRP在急性期高效合成方式的理解；揭示了二硫键形成在需要克服较高能量势垒的、非自发折叠阶段中的驱动作用，澄清了二硫键形成与构象折叠彼此间关联的长期争议；指出多途径并行折叠可能仅是简单体系中的特例，并强调了考察非自发折叠蛋白及纳入胞内环境的重要性。此外，我们还发展了可用于临床的CRP去折叠构象检测方法，发现其可能是比CRP天然构象更优越的疾病标志物；设计和制备了CRP构象锁定的动物模型，为阐明不同构象形式CRP的确切在体作用及机制提供了理想工具。