TLR4信号通路在内毒素诱导的急性肺损伤肺纤维化早期对肺成纤维细胞增殖的调控机制

革兰氏阴性杆菌内毒素的成份脂多糖（LPS）是急性肺损伤的致病因素，可引起肺成纤维细胞（LF）活化和增殖导致肺纤维化，后者是危重患者死亡的重要原因。申请者发现LPS通过Toll样受体4(TLR4)活化PI3K-Akt通路，引起LF活化。也有研究提示PTEN蛋白失活可激活PI3K-Akt通路并促进LF增殖。但目前尚未明确LPS致LF增殖的机制是否由TLR4信号通路介导并与PTEN失活及PI3K-Akt通路活化有关。本研究拟通过原代培养小鼠LF，分别抑制其TLR4表达、阻断PI3K-Akt通路、过表达PTEN基因，从分子和细胞水平探讨LPS诱导LF增殖的机制，并尝试通过对以上各环节的调控抑制LF增殖。本研究以TLR4介导的信号通路为切入点，旨在从细胞增殖的角度进一步研究内毒素诱导的急性肺损伤肺纤维化的发病机制，为探索该疾病的早期防治手段奠定基础，并为多种因素引起的肺纤维化疾病的早期防治提供借鉴。

在脂多糖（LPS）诱导的肺纤维化早期，存在肺成纤维细胞的异常增殖，但机制不明。我们采用针对LPS受体TLR4的siRNA慢病毒载体（TLR4-siRNA-lentivirus）转染小鼠肺成纤维细胞抑制TLR4表达，以研究LPS对肺成纤维细胞增殖，细胞内PI3K-Akt通路活化以及PI3K-Akt通路抑制蛋白PTEN表达和活化的作用。同时，通过转染PTEN过表达慢病毒载体过表达PTEN，以研究PTEN在肺成纤维细胞增殖以及PI3K-Akt通路活化中的作用。.经BrdU检测发现，以1 μg/mL 浓度的LPS刺激肺成纤维细胞24小时后未见细胞增殖，但LPS刺激72小时后细胞出现显著增殖；Western blot证实：LPS刺激细胞后出现PI3K-Akt通路活化（Akt磷酸化水平增高），细胞转染TLR4-siRNA-lentivirus或使用PI3K抑制剂Ly294002可以抑制细胞增殖以及PI3K-Akt通路活化。同时，real-time PCR及Western blot证实：LPS刺激细胞可引起PTEN 表达下调，而细胞转染TLR4-siRNA-lentivirus后可以抑制该过程，但改变PI3K通路的活化状态并不能影响LPS诱导PTEN表达下调的过程。使用PTEN抑制剂bpV(phen)可以引起PI3K-Akt通路活化，并发挥LPS的作用引起细胞增殖，但使用Ly294002抑制PI3K-Akt通路后可逆转该过程。此外，细胞转染PTEN过表达慢病毒载体可以有效上调PTEN的表达量及其磷酸酶活性，同时抑制由LPS诱导的细胞增殖以及PI3K-Akt通路活化过程，该过程可以被PTEN抑制剂bpV(phen)所逆转。.综上所述，本课题证实LPS能通过TLR4引起肺成纤维细胞增殖，该过程与PTEN表达下调以及由此引起的PI3K-Akt通路活化有关。由PTEN抑制引起的PI3K-Akt通路活化在肺成纤维细胞增殖过程中起关键作用，并可能加速ALI/ARDS早期肺纤维化进程。过表达PTEN并加强其磷酸酶活性可抑制由LPS诱导的肺成纤维细胞增殖反应，能成为LPS诱导肺纤维化治疗的潜在靶点。相对于PTEN的表达水平，其磷酸酶活性对调控肺成纤维细胞增殖过程具有更为关键的作用。.本课题参与培养研究生2人，研究结果参加中华医学会全国重症医学大会交流，共发表了6篇论文，其中SCI论文5篇。