人类线粒体DNA甲基化的遗传学特性及法医学应用基础研究

In the previous study funded by National Natural Science Foundation of China, we found that mitochondrial DNA (mtDNA) methylation was a valuable marker for identification between monozygotic twins (MZ) individuals. Furthermore, mtDNA methylation level showed significant tissue differences and was related with age. In this research, we will continue to study the genetic and biological characteristics of human mtDNA methylation. All the 435 CpG sites located on mtDNA across control region, 13 protein genes, 2 rRNA genes and 22 tRNA genes will be detected to draw the first complete human mitochondrial genome methylation precise quantitative profile. mtDNA CpG sites methylation level differences between MZ individuals will be analyzed to select more valuable testing sites for the identification of MZ. Tissue-specific analysis of mtDNA CpG sites methylation will be performed to explore the value of the marker for tissue identification of forensic biological samples. Longitudinal study and cross-sectional study of age will be performed to assess the possibility of mtDNA methylation for age estimation of biological samples. mtDNA methylation levels in family samples will be analyzed to clarify its genetic stability and possible inheritance mode. This study hopes to support a solid scientific foundation for the development of mtDNA methylation for forensic application.

在前一项国家自然科学基金项目研究中，我们发现线粒体DNA（mtDNA）甲基化在鉴别同卵双生子（MZ）个体中具有较高的应用价值，并且具有明显的组织差异性和一定的年龄相关性。本项目将继续深入研究人类mtDNA甲基化的遗传及生物特性，检测覆盖mtDNA控制区、13个蛋白质基因、2个rRNA基因及22个tRNA基因的435个CpG位点的甲基化情况，绘制首张完整的人类线粒体基因组甲基化定量图谱；检测mtDNA甲基化在双生子之间的差异情况，为鉴别MZ储备更多的有价值的检测位点；分析mtDNA甲基化的组织特异性，探索其在法医学生物样本组织来源鉴定中的应用价值；对mtDNA甲基化进行年龄纵向及横向研究，评估其用于生物样本年龄推断的可能性；分析家系样本mtDNA甲基化水平，阐明其遗传稳定性及可能的遗传方式。详细评估其在法医学中的潜在应用价值，为开发mtDNA甲基化遗传标记的法医学应用奠定坚实的科学基础。

本项目研究了人类线粒体基因组DNA甲基化模式，建立了两种检测方法—焦磷酸测序法及质谱法，检测人类线粒体全基因组甲基化，发现人类线粒体DNA甲基化模式与核基因组完全不同，处于极低甲基化状态。线粒体基因组中有435个CpG位点，焦磷酸测序技术检测覆盖D环区、12SrRNA、16 S rRNA、ND1、COXI、ND3、ND4、ND5、CYTB共9个区域83个CpG位点，所有区域的平均甲基化程度低于5%，大部分为0%~2%。质谱技术检测覆盖D环区，OL，9个tRNA基因TRNF, TRNL1, TRNH, TRNS2, TRNA, TRNR, TRNM, TRNE, TRNC, 12个蛋白基因ND1, ND4L, COX2，ND3，ND4, ND5, ND6, COX3, ND2, COX1, ATP6, CYTB，2个rRNA基因RNR1, RNR2共25个区域348个CpG位点，大部分位点的平均甲基化程度低于10%。整体来看，质谱技术检测值普遍高于焦磷酸测序技术，但无论哪种技术检测，D环区都是线粒体基因组中甲基化程度最高的区域。.本项目首次发现线粒体的环状结构对于甲基化的检测有重要影响，如果不进行开环处理，会导致亚硫酸氢盐转化不完全，甲基化检测值偏高，因此，以往的研究报道可能过高地估计了线粒体DNA甲基化程度。事实上，人类线粒体DNA发生甲基化在大多数区域是一个稀有事件。.本项目检测了人类不同组织（血液、唾液、心、肝、脑、肺、肾）线粒体DNA甲基化，发现其无明显的组织差异性；分析了不同年龄个体mtDNA甲基化，发现其不具有年龄相关性；且在同卵双生子间也未检测到明显差异。但线粒体DNA序列在同卵双生子间存在一定的差异，本项目应用新一代测序技术在Ion Torrant PGM平台进行线粒体DNA深度测序，发现在被检测的21对同卵双生子间，有11对检测到点异质性或长度异质性差异，占比为52.38%，提示该技术能够作为鉴别同卵双生子的检验手段之一，解决法医学相关问题。